Premier designs 引物設計

• 一種是在DNA上設計引物結合 一代測序 (Sanger) 去鑒定某個位點的基因型
• 一種是qPCR (Real time PCR)的引物構建

當然一定還有其他的引物設計方法，這裡僅僅就介紹這兩種設計方法 (誰叫我。。。就。。。學會了這兩種呢。。。喝喝)

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複習知識點，理清它們之間的區別：

Exon - Wikipedia

Coding region - Wikipedia

Untranslated region

RefSeq - Wikipedia

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需要的網站以及軟體：

IDT - INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES

NCBI - Primer designing tool

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正片開始：

qPCR引物的設計

一般你的基因有多個外顯子的話，建議引物需要跨越至少一個外顯子，會好一點，沒有的話，那就看軟體吧~~

1. 找到你所需的mRNA序列或者id, 例如NM_014952
2. 打開上面提供的IDT網站。師兄說，其它類似的網站也可以- -，但！師兄推薦這個，那就這個！！！
3. 上面的框框放ID號，下面的框框放序列文件，兩個中有一個就OK了，如下圖：

   

4. 然後點擊右邊的 Design Assays:

5. 等待很少的一段時間之後，會跳出參數可以選擇，這裡假設我們要找的基因在Exon3, Exon4上，那麼把他們兩個打勾，然後點擊Design Assays：

   

6. 產生的結果，這裡剛好只有一個，一般而言會有很多的結果產生，網站會根據網站認為的好壞進行排序，越上面的越好：

   

7. 查看這對引物的特異性，以避免其它的mRNA有和它類似的，最後實驗造成假陽性，需要進入NCBI - Primer designing tool 進行比對，輸入找到的引物序列，控制好參數，如，是否需要跨越一個外顯子，你的資料庫是什麼，這裡因為我們做的是qPCR，所以資料庫是mRNA，還有你的物種是什麼，查看：

   

8. 點擊Get Primers之後，等待：

9. 看看是否只有一種我們當初的基因存在，根據這裡的結果，我們發現並不是！！！還有一些其它的基因存在，說明特異性不是很好，怎麼辦呢？（等我問問師兄再來更新，其實我一開始選的這個基因可能不是很好。。。可能是個例外，你做的時候可能不會有這樣的問題在）

   

   

10. 做完特異性，我們要看看這段引物的二級結構之類的東西，這時候我們就要用起我們的Primer 6.0了~

11. 選擇分析模式：

12. 輸入序列，回車：

    

13. 結果，對於結果的評級。。。我只記得。。。吉布斯自由能小於4？（等我查閱資料，問問師兄之後，再來更新吧~）

    

到這裡就是qPCR引物設計的流程了。完結~~撒花~~O(∩_∩)O哈哈~

DNA片段的引物設計

這裡我們假設我們的目的是為了找出某個基因上的位點是否發生了突變

1. 你的基因文件，準備好~~這裡我們假設，我們選出的C位點發生了突變。一般我們一代測序（Sanger）長度有1K，那麼我們要保證的就是C這個位點兩端至少要有100bp的長度，然後。。。然後。。。複製到軟體里：
2. 複製這段序列，到軟體里

   

3. 輸入序列，選擇好輸入類型，我們這裡是設計DNA的引物~~：

   

4. 輸入序列之後，找引物~~選擇好分析模式：

5. 這裡可以調整參數，如果你搜索到的引物不在你的基因型，可以控制下面的尋找區間，這裡我為了找到，上面提到的區間，將910改成了600：

   

6. 得到了結果，這裡會有這兩個引物的一些信息，比對一下引物的標準，看看是否合格。最後那欄吉布斯自由能好像是小於4？記不清啦~

   

7. 如果要再看看特異性什麼的，拿到NCBI裡面去比對就可以了。

到這裡，DNA引物設計就完結啦~~撒花~~O(∩_∩)O哈哈~

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走過，路過，發現錯誤一定要留言~~~

O(∩_∩)O謝謝~~~

我會及時修改的~~~

蟹蟹蟹蟹~~~~~

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