pcr引物設計,入門級別的招式。

北京時間6點半，想著今天跟著小胖師兄學了一招怎樣設計引物，把自己學到的寫出來給大家分享分享，我在想應該有很多自學引物設計的同學會把引物設計得很好，但我就不行了，不經人指點一二，任督二脈永遠打不開~~~

得抓緊時間了，還得看提取組織的RNA的步驟呢（下午在王府井書店看到太多好看的書，兩個小時一會兒就過去了，其中發現了一本由方洛雲老師主編的《SPSS20.0在生物統計中的應用》，對於醫學生初學SPSS的來說很簡單易懂，也把SPSS的一些基本框架，界面介紹得很清楚，像我這種只會蹭書的人來說，附近有一家大型書店，簡直就是老天對我的眷顧，thank god.），好了，言歸正傳，小胖師兄說設計擴增基因的引物有兩種方法，涉及兩個資料庫UCSC（該站點包含有人類、小鼠和大鼠等多個物種的基因組草圖，並提供一系列的網頁分析工具）和NCBI中的primer blast。

首先第一種情況，擴增基因片段比較小，CDS序列在1000bp~1500bp之間的片段，我們首先在UCSC資料庫中找到它的CDS序列，例如小鼠的Foxn3基因，它的CDS序列為

ATGGGTCCAGTCATGCCTGCCAGTAAGAAGGCCGAG

AGCTCAGGAATCAGTGTGTCCAGTGGACTGAGTCAG……………………………中間省略大約1k bp…………………………………………………………GCCAGGA

AGGTCCCCAGCGACACACTGCCCCTCAAAAAGAGACGCACGGAGAAGCCG

CCCGAGAGCGATGACGAGGAGATGAAGGAGGCGGCCGGTTCACTCCTGCA

CTTAGCAGGGATTCGGTCCTGTTTGAACAACATCACCAATCGGACGGCCA

AGGGGCAGAAAGAACAAAAGGAAACCGCAAAAAATTGA

從起始密碼子ATG開始向後數15~20bp的鹼基，方向為5『-3』這是上游引物，ATGGGTCCAGTCATGCCTGC。下游引物是從最後一個鹼基倒著往前數15~20bp並寫出它的互補鹼基，方向為5『-3』，這就是它的下游引物。

這種小片段設計引物的方式就是這樣，當然，你所找出來的引物序列還得看它們還的CG百分比，上下游的GC百分比不能相差太多，不然就不能夠確定退火溫度Tm，當你數出引物序列後，再經過NCBI中的primer blast看一下它們的GC含量，根據GC含量再調整你的引物序列，可能上游引物會增加至30bp左右才會出現合適的GC含量。

那麼針對CDS序列在1500bp~3000bp這樣的大片段，就要用到小胖師兄說的巢式pcr的方法了，首先在UCSC中找到基因的序列，這裡注意的是，這次我們要找的序列包括了基因上下的5『-UTR和3』-UTR，還是以小鼠的Foxn3基因為例，

cacctttgtcctttctggagcgatgctgacctggacccattctgactcag

gagccttcacgtaaATGGGTCCAGTCATGCCTGCCAGTAAGAAGGCCGAG

AGCTCAGGAATCAGTGTGTCCAGTGGACTGAGTCAGCGTTACCGGGGCAG

CGGTTTCTCCAAGGCCCTCCAGGAAGACGATGATCTTGACTTCCCTCTGC

CCGACATCCGATTAGAAGAGGGGGCCATGGAAGATGAAGAGCTGACCAAC

CTGAACTGGCTGCATGAGAGCAAGAACTTGCTGAAGAGCTTTGGGGAGTC

GGTCCTTAGGAGTGTCAGTCCTGTGCAGGACCTAGACGATGACACCCCAC

CATCCCCTGCCCACTCGGACATGCCCTATGATGCCAGGCAGAACCCCAAC

TGCAAGCCCCCCTACTCCTTTAGCTGCCTCATATTTATGGCCATCGAGGA

CTCTCCGACCAAGCGCCTTCCAGTGAAGGACATCTACAACTGGATCTTAG

AACATTTCCCGTATTTTGCAAATGCACCTACTGGGTGGAAGAACTCAGTG

AGACACAACTTGTCATTGAATAAGTGTTTCAAGAAAGTGGACAAAGAGAG

GAGTCAGAGTATTGGGAAAGGGTCATTGTGGTGCATCGACCCAGAGTATA

GACAAAATCTAATTCAGGCTCTGAAAAAGACACCTTACCACCCACCTCCT

ACTCCTCAGGCTTATCAAAGCACATCAGGTCCACCCATCTGGCCGGGCAG

TACCTTCTTCAAGAGAAACGGAGCCCTCCTGCAAGTTTCTCCAGGAGTGA

TACAAAATGGAGCGAGGGTTCTGAGTCGAGGGCTGTTTCCTGGTGTCCGG

CCGTTACCAATCACTCCCATTGGGATGACGGCAGCCATAAGGAATAGCAT

CACCAGTTGCAGGATGCGGACTGAGAGCGAGCCCCCATGTGGCTCCCCAG

TGGTCAGTGGCGATCCGAAGGAGGACCACAACTACAGTAGTGCCAAGTCC

TCCACTGCCCGGAGCACCTCTCCCACCAGCGACTCCATCTCCTCTTCCTC

CTCCTCAGCCGACGACCACTATGAGTTTGCTACGAAGGGGAGCCAGGAGG

GCAGTGAGGGAAGCTTCCAGAGCCATGAGAGCCACAGTGAACCAGAGGAG

GAGGACCGGAAACCCAGCCCGAAGGAAGGCAAGGATGCCCTGGGGGACAG

CGGATACGCATCCCAGCACAAGAAGCGCCAGCACTTCGCCAAGGCCAGGA

AGGTCCCCAGCGACACACTGCCCCTCAAAAAGAGACGCACGGAGAAGCCG

CCCGAGAGCGATGACGAGGAGATGAAGGAGGCGGCCGGTTCACTCCTGCA

CTTAGCAGGGATTCGGTCCTGTTTGAACAACATCACCAATCGGACGGCCA

AGGGGCAGAAAGAACAAAAGGAAACCGCAAAAAATTGAaacaagtctctg

atttgttttgaacttatggccatttggtttcagcatgtcaggagatttct

aatgatttgtggcaatatcagcaatttttttcttttttcttttttttttt

ttcttttttccttttgttggtttggttttcttttctttctttctttcttt

cttttgttttttaatttgccccccactcctttgtttttggacccttaaaa

ttttttctgtttaaaggagattgaagccatagaaactcatattgacactc

小寫字母為UTR序列，大寫字母為CDS片段，那麼選取UTR的部分（不用全部）再加上完整的CDS片段的序列copy至NCBI中的primer blast

如下圖，

出來這樣的界面

這裡需要設置一下pcr product size，就是pcr產物的大小，一般你的CDS含鹼基數多少，那就是最小值，例如1370，那麼max 就可以輸入1400

接下來，

Organism需要改成你那種基因的種類比如小鼠就輸入mouse啦~

然後其它參數都不用去設置了，點擊 get primers

然後結果界面就出來啦~

選取你覺得最好最適合的那對引物就大功告成了~~~

若有什麼問題，歡迎留言，我不能解決的，找小胖師兄來給你們解答~~~

好了，希望明天提取組織RNA一次過~~~~

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「在鋼筋水泥的結構中呆久了，身體裡面對於大自然的嚮往就越來越濃厚了」
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