【技巧】Elisa常見樣本處理

Elisa是一種快速、靈敏、準確可靠的定量分析方法。樣本的處理對於 Elisa 實驗的成功

有舉足輕重的作用。

利用 ELISA 進行檢測的樣本類型包括：血液（血清、血漿），組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清，皮膚組織、尿液、糞便、肺泡灌洗液、唾液、腦脊液、胸腹水、前列腺液、精液、陰道分泌物等。

下面我們就常見的樣本處理方法：

血液樣本

血液採取後應儘快進行處理，使血清（漿）從與血細胞接觸的全血中分離出來。

Q: 血清與血漿的區別?

A: 血清是血液凝固後缺少纖維蛋原的血漿，故血漿中除尚含有纖維蛋白原和 抗凝劑外，其他成份均等同於血清。

Q: 選擇血清還是血漿樣本？

A: 由於血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血產物。如果測凝血因子建議選擇血漿樣本；同時血漿中有纖維蛋白原，如果纖維蛋白原對待檢測指標有影響，建議選擇血清樣本。

大多數情況下二者均可以選擇。

處理方法：

血清：將收集於血清分離管的全血標本在室溫放置 2 小時或 4 度過夜，然後1000×g 離心20分鐘，取上清即可。這是一個讓血液自然凝固的過程，溫度越低，凝集越緩慢，可根據需要添加促凝劑。

血漿：血漿樣本需要抗凝，一般建議用2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸櫞酸鈉作為抗凝劑採集標本，並將標本在採集後的30分鐘內於2~8度1000g離心15分鐘，取上清即可檢測。根據待檢測目標物的性質不同選取不同的抗凝劑。

• 枸櫞酸鈉(檸檬酸鈉)：Ca2+有凝血作用，枸櫞酸鈉能與血液中的鈣離子形成可溶性的螯合物，從而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的濃度和血液1:9, 106mmol/L的濃度和血液1:4

缺點：血液中溶解度低，抗凝作用較弱。

優點：對凝血因子有很好的保護作用，大部分凝血試驗都可用枸櫞酸鈉抗凝。

• 二胺四乙酸（EDTA）鹽：與血液中的鈣離子結合形成配位化合物， 從而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10

優點：對紅細胞和白細胞形態影響小。

缺點：影響血小板的聚集。不適用於凝血實驗和血小板功能相關實驗的檢 測。

• 肝素：通過與抗凝血酶Ⅲ結合，增強抗凝血酶的作用，滅活絲氨酸蛋白 酶，從而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。肝素鈉 1g/L 與血液 1:10

優點：抗凝能力強、不影響血細胞體積、不易溶血、能耐高溫。

缺點：引起白細胞聚集。肝素抗凝血應於短時間內使用，否則放置過久血 液又可凝固。

組織樣本

（組織樣本一般是製成組織勻漿）

處理方法：

1）取適量組織塊，於預冷 PBS（0.02mol/L, pH 7.0-7.2）中清洗去除血液， 稱重後備用（組織塊較大需先剪碎後再勻漿）；

2）可同時選用多種勻漿方法達到較好的破碎效果：首先將組織塊移入玻璃 勻漿器，加入 5-10ml 預冷 PBS(組織與 PBS 的質量體積比建議為 1:5，即 1g 樣 本加入 5ml PBS)進行充分研磨（有條件實驗室可選用機器勻漿），該過程需在冰 上進行；得到的勻漿液可再利用超聲破碎或反覆凍融進一步處理（超聲破碎過 程中注意冰浴降溫；反覆凍融法可重複 2 次）。

3）將製備好的勻漿液於 5000×g 離心 5 分鐘，留取上清即可檢測。

4）如果樣本需要長期保存，請添加蛋白酶抑製劑。根據實驗需要，組織勻 漿樣本可先定量總蛋白,以便於統計分析數據。某些組織樣本如肝臟，腎臟，腦 組織會有假陽性反應。

細胞樣本

根據目的物所在部位，可選擇細胞裂解液或細胞培養上清作為樣本。需要注意的是：

因該類樣本干擾因素較多，所以可能存在檢測不出的情況。

如果目的物是分泌型，主要在胞外，即可選擇細胞培養上清作為樣本；

如果目的物主要存在於胞內，則建議選擇細胞裂解液作為樣本類型。

處理方法：

細胞培養上清：處理方法相對簡單，取細胞培養上清，1000×g 離心 20 分 鍾，取上清即可檢測。

細胞裂解液：

1）貼壁細胞需要先用胰酶消化，離心收集細胞（懸浮細胞可直接離心收 集）

2）將收集到的細胞用冷 PBS 洗 3 次

3）物理方法裂解細胞（可先超聲破碎細胞，再反覆凍融）：

i 超聲破碎：取適量 PBS 重懸細胞，用一定功率的超聲波處理細胞 懸液，使細胞急劇震蕩破裂；

ii 反覆凍融：將待破碎的細胞在-20 度以下冰凍，室溫融解，反覆 3 次，使細胞溶脹破碎；

4）將標本於 2-8 度 1500×g 離心 10 分鐘，收集上清備用。

一般情況下，物理方法如反覆凍融，勻漿等方法會比化學方法好，因為化 學方法會引入酸或鹼，可能會對 elisa 實驗產生影響。我們也做了相關實驗來評 測化學提取液和洗滌劑對 ELISA 檢測的影響，如 RIPA、TritonX-100、NP-40 和 SDS、脫氧膽酸鈉、β巰基乙醇、DTT。

痰液

1）選擇痰液中較為粘稠部分稱重，加兩倍於痰量的 0.1% DTT(二硫蘇糖醇)， DTT 的主要作用是溶解粘液，用吸管反覆吹打，漩渦器振蕩 15s，37 度恆溫水浴振蕩 5 分鐘；

2）加入兩倍於痰量的 PBS 緩衝液繼續振蕩 15-20 分鐘，150 目的金屬絲網過濾，1500 rpm 離心 10 分鐘吸取上清液檢測。

糞便

盡量採集乾的糞便，糞便過稀會較難處理且降低檢測的準確性。採集的重量應大於50mg，將糞便用PBS洗3次（最終糞便質量：PBS 體積=1:9），用超聲粉碎（或搗碎）後於5000×g離心10分鐘，取上清檢測。

唾液

將樣品收集於離心管後在-70 度冰凍 1 小時。在冰上融化樣品後，2000×g 離 心 10 分鐘，取上清檢測。

精漿

將精液收集於無菌容器中，正常精液射出體外呈稠厚的膠凍狀，射出體外後需在室溫或 37 度水浴箱中使其在前列腺分泌的纖維蛋白溶解酶的作用下液化變的稀薄。待精液完全液化後，將精液 4000 rpm 離心 10 分鐘分離精漿進行檢測。

皮膚組織

用勻漿機加冰的 PBS 研磨 20-50 mg 的皮膚組織使其充分溶解，離心 20 分 鍾，10000 g/分鐘，取上清檢測。

牛乳

於4度，12000g／分鐘離心30分鐘，去除上層脂肪，以及下層沉澱，取中間層樣本用於檢測。

腦脊液、肺泡灌洗液

樣本收集後於1000×g 離心20分鐘，離心後收集上清，並將標本保存於-20度，且應避免反覆凍融。

處理樣本的過程就是收集目標蛋白的過程，由於蛋白容易變性，降解，故 該過程應盡量溫和。樣本處理之後的儲存也非常重要，尤其注意不要反覆凍融， 樣本處理之後可分裝密封保存，4 度保存應小於1周，-20 度不應超過1個月，-80 度不應超過2個月。

在標本使用前應緩慢均衡至室溫，不應加熱使之融解。樣本的處理是實驗成功的第一步，以上就是關於Elisa特殊樣本處。

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