中藥現代化的策略淺析——以青蒿素合成為例（上）（喵201）

中藥現代化是近期中醫藥研究的熱點問題，今日，國家食品藥品監督管理總局辦公廳發布《中藥經典名方復方製劑簡化註冊審批管理規定（徵求意見稿）》，對中醫經典藥方的審核加快流程，昭示著我國對於傳統醫學繼承與發展的決心。

那麼，從事生命科學研究的我們，想必有一部分的同學是為了藥物開發、生物製藥這樣的名詞來到這樣一個領域，在這裡，我們將結合「中藥現代化」和「生物製藥」這兩個領域，來解析天然藥物的發現與生產研究。

首先，中藥，又稱中草藥，絕大部分的中藥來自於植物的次生代謝產物，這些次生代謝產物往往來源於植物細胞中的某種底物，如氨基酸、糖類等，最終生成對植物而言有著抗菌、抗蟲、傳遞信號等作用的小分子化合物。

其次，生物製藥，關乎生物反應器的概念，傳統的生物反應器利用一些原核或單細胞真核生物，採用發酵的手段生物合成小分子多肽類藥物和一些特殊的大分子蛋白類藥物，對於此類藥物來說，黑麴黴、乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌、大腸桿菌都是優良的蛋白表達系統；

然而，源於次生代謝的天然藥物，很多都是結構複雜的小分子化合物，這些化合物往往需要複雜的酶系進行催化，因此，遺傳背景清晰、轉化體系成熟以及代謝背景適宜往往成為了新型小分子化合物藥物生物反應器的需求，其中，大腸桿菌、酵母、煙草等合成生物學底盤成為了主流的選擇。

人們最早使用次生代謝產物治療疾病，要追溯到上個世紀初，弗萊明從青黴菌中提取到了青黴素，拯救了二戰時期無數受傷的生命；有趣的是，今天要跟大家分享的，在植物天然產物中最具代表性的藥物，名字中也帶有同樣的字眼，它就是青蒿素。

青蒿素之所以舉世聞名，皆因為2015年，屠呦呦與另外兩位科學家分享了當年的諾貝爾生理學與醫學獎，而屠呦呦獲得此獎的原因，正是因為其提取鑒定了對於瘧疾的治療有著卓越療效的一種萜類藥物，青蒿素。

在越南戰爭期間，有無數的士兵在越南的叢林中感染了瘧疾，受到當時北越政府的請求，中國開始研發抗瘧疾的相關藥物，而在此之中的很多故事，最終導致了青蒿素的發現與阿爾特密斯綜合療法的發明。

關於瘧疾的治療，我曾經在一個回答中呼籲啟動基因驅動技術結合抗瘧疾基因，改造埃及伊蚊群體，使其不再傳播瘧疾：

為什麼不滅絕蚊子？?

www.zhihu.com

你也可以直接關注那次TED演講，了解人類抗爭瘧疾的殘酷與新希望的曙光：

http://open.163.com/movie/2016/7/J/D/MBNUHUC2R_MBOE47QJD.html?

open.163.com

在這裡，我們且說說青蒿素與合成生物學，也就是前面所說的：天然藥物的發現與生產——基於天然產物化學的藥物發現、基於分子生物學的基因克隆和基於合成生物學的生物製藥；

青蒿素，是一種倍半萜內酯，如今，我們已經可以用酵母發酵得到超過25g/L的青蒿素產量，這也使得我們可以更有效地治療被瘧疾感染的病人；

從黃花蒿（學名）中提取青蒿素，並分離鑒定各種化合物，是屬於化學家的工作，在這個過程中，我們從植物或者其他生物中分離鑒定出所有的化合物，找出那些我們不熟悉的面孔（新化合物），即這種生物所特有的化合物群，進而推測各種化合物在體內代謝上的關係，隨後大量分離提純這些化合物，實現其體外的化學半合成，以證實我們推測的反應是否真的能夠發生。

這些都是化學家的工作，基於此，我們得知了青蒿素在體內是怎樣由初生代謝產物變為青蒿素的：這部分研究的歷史已經太過久遠，因此，在篇專欄文章中，主要給大家介紹的是青蒿素生物合成路徑的定位以及代謝工程的實現。

青蒿素的生物合成途徑，主要分成了四個部分：

1. 通過甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸兩條途徑形成法尼基焦磷酸FPP；
2. 在紫穗槐-4,11-二烯合酶的作用下，將FPP環化形成青蒿素的中間體紫穗槐-4,11-二烯；
3. 在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶的作用下，紫穗槐-4,11-二烯進一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛，進而合成青蒿酸和/或二氫青蒿酸；
4. 青蒿酸和/或二氫青蒿酸通過一系列酶反應和/或非酶反應形成青蒿素。

在這個過程中，我們可以發現，甲羥戊酸途徑是可以在細胞質（Cytoplasm）中進行的，而非甲羥戊酸途徑是在葉綠體（質體，Plastid）中完成的，這就涉及到了底盤選擇的問題，如果選擇微生物底盤，那就需要走甲羥戊酸途徑；如果選擇植物底盤，那就可以走非甲羥戊酸途徑。

在此之後的一系列反應，均可以在細胞質中進行，這就為利用微生物底盤合成青蒿素創造了有利的條件——相比之下，一些只能在葉綠體中進行的反應，就不得不使用藻類或植物底盤來進行了。

我們可以發現，反應之中有幾個關鍵節點：

1. IPP，是細胞質和質體中兩個途徑的交匯點，也是進入青蒿素合成途徑的關鍵中間體；
2. FPP，是初級代謝的終點，次級代謝的起點；
3. ADS，合成了關鍵中間產物，紫穗槐二烯；
4. CYP71AV1，是紫穗槐二烯的氧化酶，該酶催化紫穗槐二烯一路直到青蒿酸；
5. Dbr1和Dbr2，是產生藥效更強的二氫青蒿素的關鍵酶；
6. A1dhI，是氧化青蒿醛、二氫青蒿醛變為對應的青蒿酸的關鍵酶；

根據這些關鍵節點，我們來進行詳細解析：

如何產生FPP？

如何產生FPP？這是青蒿素生物合成的第一步，想辦法產生FPP，或者選擇本身就能產FPP的底盤：

——這就是做藥物代謝工程研究的第一步，選擇底盤；

選擇底盤的時候要考慮這麼幾個問題：

1. 有無中間代謝產物，如果有，量上能否滿足目標化合物生產的需求；
2. 根據底盤的遺傳背景，選擇合適的基因調控元件，能夠實現各種水平的表達；
3. 底盤的轉化體系足以轉入我們所需要的一系列基因；

延伸開來講，第一條，我們需要建立底盤的代謝途徑庫，對底盤的代謝背景充分了解，在這個過程中，KEGG代謝途徑庫、Reactome代謝途徑庫是重要的參考：

KEGG代謝途徑庫：http://www.genome.jp/kegg/pathway.html

Reactome代謝途徑庫：https://reactome.org/

推薦KEGG，至於Reactome雖然界面更友好但實際上對於代謝途徑來說，非常難用；

第二條，關於合適的調控元件，往往需要查閱相關文獻來得知，中科院有一個相關的元件庫，可以參考：http://npbiosys.scbit.org/regulatoryElement；

第三條，需要對整條代謝途徑的了解，如何最優化插入片段的涉及，降低整個DNA序列的長度，並了解一系列底盤的相關研究進展，比如酵母染色體的人工合成；

選定了底盤，就可以進行轉化的嘗試了，就目前的合成生物學技術來說，遠遠無法做到隨心所欲的合成基因組的水平，因此，轉入更少基因就可以實現目標化合物的合成的底盤自然是最優的選擇。

在青蒿素的生物合成中，甲羥戊酸途徑成為了微生物底盤中的首選：

關於甲羥戊酸途徑中的各步反應暫時先不做介紹，我們主要關注青蒿中其後的一系列次生代謝反應——我們需要從植物中定位並克隆這些基因，轉入新的底盤中以進行催化合成。

第一步是得到由FPP到紫穗槐二烯的酶，這個酶是，得到ADS之後，下一個節點是CYP71AV1（由紫穗槐二烯到青蒿酸）；

2005年，Bertea等用青蒿葉片微粒體（破碎細胞，細胞內膜結構自行重構封閉形成的小囊泡）處理紫穗槐二烯，在產物中得到了青蒿醇，由此推斷在青蒿中存在一個P450氧化酶，能夠將紫穗槐二烯催化成青蒿醇；

隨後，2006 年，Keasling和Covello先後從青蒿腺毛中克隆得到了CYP71AV1，能夠將紫穗槐二烯連續地催化成青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸，是一種多功能酶。

2008年，Zhang等通過綜合運用蛋白部分純化、質譜和EST文庫的方法從青蒿中克隆得到一個青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶基因,命名為Dbr2。Dbr2在腺毛中表達最高，特異性地作用於青蒿醛，生成11R-二氫青蒿醛，對青蒿酸、青蒿醇、artemisitene和arteannuin B均無活性。2009年，他們又分離到了Dbr1，這個酶的產物以11S-二氫青蒿醛為主。

2009年，Teoh等從青蒿中分離得到1個醛脫氫酶基因，命名為Aldh1，ALDH1能作用於青蒿醛和二氫青蒿醛，生成相應的青蒿酸和二氫青蒿酸。

在此之後，由於由青蒿酸到青蒿素的合成途徑不是很清楚，而化學合成的耗費也不是很高，因此在目前的代謝工程研究中，從青蒿酸到青蒿素的步驟，是化學合成的。

目前，在酵母中、煙草中均實現了青蒿素的生物合成，從以上對於基因功能和克隆的研究來看，從IPP到青蒿醛，我們只需要逐步完成以下思路，即可合成得到二氫青蒿素：

1. 在底盤中大量得到FPP；
2. 轉入ADS、CYP71AV1、A1dhI得到青蒿素；
3. 轉入ADS、CYP71AV1、Dbr1(Dbr2)、A1dhI得到二氫青蒿素；

單看2、3，需要進行的改造其實並不多，但底盤中基礎代謝的改造必不可少，在這一部分上，微生物底盤與植物底盤所需要的基因元件是不一樣的。

首先，研究的最初階段，採用過表達大腸桿菌自身的DXP途徑的策略來合成IPP、DAMPP、FPP等萜烯類化合物，但由於大腸桿菌自身的抑制合成機制，產物並沒有大幅度提高：Biotechnol. Bioeng. 87, 200–212 (2004).；

MVA途徑是釀酒酵母中產生萜烯類化合物的主要途徑，將MVA途徑引入大腸桿菌，再引入ADS合酶，工程菌可產生24mg/L的紫穗槐二烯，在進行密碼子優化和發酵條件優化後，產量達到了0.5g/L。

大腸桿菌底盤的優勢在於轉化手段十分成熟，但因為其DXP途徑產生的萜烯類化合物含量較低，需要轉入外源代謝途徑，但是在第一個質粒MevT中，三個酶的表達不均衡導致中間產物累積，抑制了細胞的生長；

隨後，研究人員發現，tHMG1的酶活性增加可以解決這種抑制，其機理是前兩個酶活性較高，導致了HMG-CoA的積累，而HMG-CoA的積累會消耗大量的A-CoA，導致脂肪酸合成減少，細胞膜的合成受阻，可以通過添加棕櫚酸來解決這個問題。

隨後，研究人員調整了一些元件，導入了來自金黃色葡萄球菌的兩個元件，該策略搭配限制性氮源和碳源的補料手段，將大腸桿菌中紫穗槐二烯的產量提高到27.4g/L。

隨後，轉入一系列合成酶系，得到了1g/L的青蒿酸產量，但需要20℃才能進行發酵。

研究至此告一段落，但1g/L的發酵產量還不能滿足生產需求，那麼，如何提高產量呢？

讓我們在下一篇專欄文章中為大家講解。