小中見大」的器官晶元，如何助力新葯開發

本文首發葯渡微信，作者: 做葯的土豆

新葯研發的失敗率之高是眾所周知的，以抗癌藥物為例，全美每年因為研發失敗損失的費用在8-14億美元之間。一方面，依靠動物實驗獲得臨床前數據來預測藥物的藥效、毒性以及在人體中的PK(葯代動力學)參數，是新葯研發過程中的「標準操作」。 但是由於動物和人的種屬間差異，不可避免的造成預測偏差， 導致很多藥物臨床前和臨床試驗的橋接失敗，最終導致開發失利。另一方面，以體外細胞模型來替代動物實驗，當前的體外模型主要依靠二維或者簡單的三維細胞培養體系，簡單快速高通量是它的優勢，廣泛用於早期化合物的篩選。 但是這種通過培養皿和多孔板培養出的簡單細胞模型生理功能不完整，並且沒有考慮組織間的相互作用，並不能夠準確反映生理狀態下的機理 ，對化合物的選擇構成誤導。因此，不論是動物實驗還是體外實驗，都很難準確預測藥物在人體中的行為。 行業迫切需要與生理功能更相關，精準性更高的藥物篩選平台。

上世紀90年代，研究微全分析系統(Micro Total Analysis Systems, μTAS)的科學家們提出了基於微流控技術的器官晶元(organ-on-a-chip)概念。做為一種潛在的細胞試驗新型工具，在器官晶元研究之初主要是將概念落地，還遠沒有達到實際應用的目標。近年來，隨著技術的成熟，越來越多的資金投入到這一領域，應用前景也明朗起來。本文對器官晶元目前的技術發展現狀，以及如何參與藥物研發和應用中遇到的問題做了整理。

微流控技術和細胞擦出的靈感

微流控技術整合了微米/納米技術、化學感應器和分析化學技術。微流控裝置通常由像照平印法或軟印法等半導體微製造技術製成，可以用於微通道或微結構的化學分析，又被稱為「晶元實驗室」(Lab-on-a-chip)。就像上面所述，體外細胞評價體系存在細胞失活和生理功能缺失等不足，即使是原代培養細胞也有這些現象。同時，經典方法的細胞培養環境是相對靜態的，待測藥物加樣後主要通過被動擴散進入細胞，這與體內的真實情況差別較大。在體內細胞既可以通過血液獲得氧氣和營養，也會接受化學和生理的刺激，比如其微環境帶來的細胞拉伸和剪應力等。

這些體內外從形態到環境的差異導致了所培養細胞系的功能缺失，為了填補這一巨大空隙，從2000年開始 μTAS 和組織工程學的研究人員聯手開發基於微流控技術的細胞裝置，充分發揮其具有液體共振、細胞粘附、機械刺激等優勢來複制組織功能，形成了現在的器官晶元的雛形 。近年來微製造、細胞工程學、成像技術的發展幫助器官晶元成為體外仿生的創新技術，吸引了美國NIH、FDA、歐洲和日本等政府和機構的資金支持。特別是隨著誘導性多能幹細胞(iPS)技術的發展，將器官晶元作為組織模型或疾病模型已廣泛應用於新葯研發中。

器官晶元的應用

目前已有的器官晶元包括肺、肝臟、腎臟和腸道，下面一一介紹。

晶元肺

晶元肺在器官晶元中發展的最早，這種微流控細胞裝置又被稱為「會呼吸的肺」。哈佛大學的Ingber研究團隊發明的晶元肺主要包括一個雙層通道結構，由硅樹脂和多聚二甲基硅氧烷組成的微孔膜垂直隔開。 膜的上層是肺泡上皮細胞，下層是血管內皮細胞，分別給予流動空氣和培養基來。除了複製肺細胞的功能，這層微孔膜還可以在兩側通道內部壓力改變的作用下做周期性的收縮，模擬肺泡在呼吸時的生理性舒張和收縮運動 。利用這種晶元肺，研究人員發現血管內皮細胞在暴露於TNF-α和細菌環境下能夠做出炎症應激並高表達ICAM-1。在另一項毒性評價中，微膜在舒展狀態下，納米微粒能夠更多的攝取到血管一側，這與動物實驗的觀察一致。以上研究都表明晶元肺作為體外疾病模型可以滿足新葯開發的需求。

晶元肝臟

肝臟在藥物代謝過程中所發揮的重要作用不需贅述，新葯開發過程中準確預測肝臟對藥物的代謝能力和藥物在肝臟中的毒性蓄積非常重要。目前的體外實驗中所用肝細胞的酶活和功能有缺失。Powers的研究團隊用微流控技術構建了三維形態學結構的晶元肝臟，並使其處於持續的灌注狀態下。這一裝置的每個通道由一個具有留存細胞功能的濾膜和一個細胞培養腔體組成，培養基從上至下灌注每一個通道。根據估算出的細胞耗氧值設置流速，以提供符合生理範圍的流體剪應力。研究證明這種晶元肝臟能夠使細胞聚集生成肝腺泡結構，並在兩周內保持結構及相應的生理功能。

除了結構要盡量仿生，保持肝細胞的極性轉運能力也很重要。以中央靜脈為中心，肝細胞呈放射狀排列成肝細胞索，相鄰的肝細胞之間有膽小管，膽汁通過膽小管彙集起來最終通過膽管排泄。膽汁中有很多在肝臟中生物轉化而來的藥物代謝產物，經過膽管排泄。因此，膽汁排泄在藥物代謝體外研究中是個重要內容。Nakao和他的團隊發明了一個體外肝小葉模型裝置，可以複製肝細胞索的功能。 這個裝置的細胞培養區將肝細胞平行排成兩列，形成與肝細胞索相似的結構。研究發現這些整齊排列的細胞能夠沿著細胞索生長形成膽管結構 。研究人員利用藥物CDFDA來測試該晶元的代謝功能，CDFDA能夠在肝酯酶的作用下代謝為一種熒光產物CDF，再通過膽汁排泄。載有CDFDA的培養基流過該裝置的血管通道後，在細胞形成的「膽管」結構中檢測到了CDF。 這一結果證明應用微流控技術製造的晶元肝臟可以模擬組織形態及相應的生理功能 。

基於微流控技術的各器官晶元(圖片源自參考文章)

晶元腎臟

腎臟在體內負責藥物代謝和排泄。在臨床前篩選階段，評價候選化合物的腎臟蓄積和毒性通常要做動物體內實驗，目前還沒有更好的體外模型。由種屬腎毒性差異造成的藥物失敗也不在少數，發展出高效準確的體外腎毒性評價體系是新葯研發迫切需要的。進一步說，如果有一個體外模型不僅能夠預測腎毒性，還能反應腎臟疾病背後的機理，用於相關藥物的篩選，則是更好不過了。

時下的晶元腎臟是在晶元微通道底層鋪就MDCK細胞系和人源HK-2細胞系，再施以相應的剪應力。 研究表明這種細胞構造可以逐漸呈現厚度增加，Na/K ATP酶表達提高和纖毛形成，基本達到模擬腎細胞生理功能的目的 。另一種模擬腎小管重吸收的微孔膜晶元模型，是通過在基底側通道加入vasopressin和aldosterone等激素，製造基頂側包括鹽濃度和滲透壓改變的生理應激。研究人員發現剪應力不僅能調整細胞生長方向，還能促進Pgp蛋白的表達、纖毛生長和細胞白蛋白葡萄糖的吸收。Musah團隊利用微流控技術和人源iPS衍生的足狀突細胞複製了腎小球結構。能夠模仿包括剪應力的生理功能，可以作為體外腎臟模型篩選癌症藥物。以上結果說明即便結構和功能複雜如腎臟，利用微流控晶元技術也能得到保持基本腎臟功能的體外模型。

晶元腸道

作為主要負責消化和吸收的組織器官，腸道特別是小腸對口服藥物起到屏障的作用，預測其吸收功能對新葯研發十分重要。Kimura的研究團隊發明了一種搭載光探測系統的小腸晶元裝置。包括兩個膜上培養Caco-2細胞的微孔膜隔開的獨立腔體，該腸晶元具有轉運體功能，可以評價藥物的吸收，但是生理功能不完整。Kim的研究團隊發明的晶元腸道能夠模擬剪應力和周期性拉伸等生理刺激，暴露在這種仿生環境里的Caco-2細胞能夠自發生長出絨毛並進行細胞分化。為了複製更複合體內的生理環境，研究人員又將這一系統的腸道細胞與很多共生菌一起孵育。 改進的晶元腸道能夠得到與之前動物實驗或人體實驗相同的結果，表明晶元腸道可以作為腸道生理功能和疾病機理評價的體外平台 。

「身體」晶元

利用微流控技術製備器官晶元是一回事，將不同器官晶元再相互關聯，組成更複雜的「身體」晶元又是另一回事，因為想要精準預測各組織器官間的相互作用是很困難的。類似的裝置已經有所嘗試，利用這種晶元可以得到藥物連續的PK和ADME(吸收、分布、代謝和排泄)數據，並利用這些參數建模來預測藥物在人體中的代謝過程。

Shuler和他的同事從事生物工程領域前沿研究，他們發明了一種包括多個組織腔室，將不同組織細胞共同培養的身體晶元，稱為uCCA (micro cell culture analog)。研究人員利用該晶元系統對比了抗腫瘤藥物Tegafur在PO和IV兩種給葯途徑下的組織器官間相互作用，結果證明該系統可以很好的得出與動物實驗相似的數據。Imura的研究團隊也製造了另一款身體晶元，集成了小腸細胞的吸收功能，肝臟細胞的代謝功能，腎臟細胞的排泄功能。利用該晶元對一系列不同吸收程度和治療機制的抗腫瘤藥物進行了對比實驗，得到的藥效差異證明了裝置的可行性。雖然以上晶元裝置模擬了器官間的相互關聯，但是獲得的參數不能直觀反映生理功能。Kimura的研究團隊製造的身體晶元納入了體內的各項生理參數，比如組織容積比和血流量等，可以用於抗腫瘤藥物藥效評價。

基於PBPK原理打造的「身體」晶元(圖片源自參考文章)

必須承認的是，這些身體晶元技術還遠稱不上成熟，它們不能夠複製所有體內的生理功能。其實身體晶元的重要意義到不在於真的創造一個複雜的「微型人體」，而是利用體外技術來揭示藥物在體內各器官間的相互作用和代謝轉化途徑，並利用獲得的參數建模預測藥物體內過程。換而言之，身體晶元需要與PK模型合用來預測和解釋機理及現象。以上所介紹的身體晶元可以應用於不同的藥理毒性研究，通過引入不同細胞和基質來獲取數據，再結合數學模型來構建PK預測的評價體系。

器 官晶元發展面臨的挑戰

儘管發展迅速， 但是器官晶元還不能代替動物實驗，在晶元技術和生物機理兩個方面都有各自的瓶頸 。首先是器官晶元檢測技術的短板，時下的評價體系無外乎直接觀察或者測量功能參數。但是最有應用價值的體外模型應該是具備觀察和記錄對不同生物刺激信號產生特定生理應答的系統。因此我們需要繼續發展檢測技術和生物化學技術，使得在微流控裝置的微縮空間內能夠更好的完成生物化學分析。其次，複雜的微流控晶元製備過程也限制了這一技術的發展，只有實現自動化製備，器官晶元才能真正推廣開來。此外，還有一個生物學問題就是細胞系的來源，目前使用的永生細胞系多是來源於組織功能缺失的腫瘤細胞；原代人源細胞的使用雖然能夠相對準確的預測PK參數，但是也有捐贈來源和花費的問題。也許將來人源iPS誘導細胞的廣泛使用可以彌補這方面的不足。

雖然時至今日，尚無器官晶元在藥物開發中成功應用的例子，但是器官晶元無疑是一個很有應用前景的藥物開發輔助工具。 交叉技術的發展往往面臨相同的問題，那就是跨學科的技術溝通 。就像器官晶元的研發，生物科學家知道問題出在哪裡，但是不知道如何解決；而工程技術人員知道如何製造晶元，但是他們並不知道它能夠解決什麼問題。只有將醫學、製藥、生物和工程學各領域的技術整合，才能讓器官晶元百尺竿頭，更進一步，更好的為人類健康服務。