「二師兄」克隆豬問世：可精準模擬人類亨廷頓舞蹈病

? 繼「大師兄」被克隆以來，能精準模擬人類疾病的「二師兄」也成功地被克隆出來

導語：

在廣州九龍鎮有一座「豬賓館」，生活著一群身嬌肉貴的實驗小豬，它們能精準地模擬人類的疾病。這是因為科學家利用基因「剪刀」—— CRISPR/Cas9，精準地把人突變的亨廷頓基因HTT敲入到豬的亨廷頓基因中，從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。這些經過改造的豬可應用於人類試藥、幹細胞的臨床前評價等領域，最終將造福人類健康。這項研究也是繼今年1月以來，中國科學院神經科學研究所一組學者在克隆猴領域取得的重大突破以來，該領域又一重要的發現。

撰文 | 孫小橘、木三子

責編 | 葉水送

知識分子為更好的智趣生活 ID：The-Intellectual

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經過四年努力，由暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員以及美國Emory大學李世華教授領銜的國際研究團隊，首次利用基因編輯技術CRISPR/Cas9和體細胞核移植技術（SCNT），成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經退行性疾病。

?這項研究的三位通訊作者，李世華（前排左）李曉江（前排中）和賴良學（前排右）。

?亨廷頓舞蹈症豬模型的構建，研究的共同第一作者分別為閆森副研究員、塗著池博士和劉朝明。

?HD 基因敲入豬製備流程圖

這項研究為開發治療亨廷頓舞蹈症，提供了穩定、可靠的動物模型，也為培育其它神經退行性疾病大動物模型提供了技術和理論依據，將推動我國發展出大動物疾病模型的醫藥研發產業鏈，相關研究於北京時間3月30日在線發表在國際頂尖學術期刊《細胞》雜誌上。

李曉江對《知識分子》表示，「我們把這個動物模型建起來之後，也可以建立其他的疾病動物模型，如阿爾茲海默症、帕金森病等疾病的豬模型，它們要比小鼠的疾病模型會更好。因此從動物模型的構建來說，這有重要的意義；第二點，我們可以用這個模型來篩選藥物治療的方法，如小鼠動物模型由於缺乏神經元死亡重要的病理特徵，用藥評價一般都是基於行為學觀察，而豬是非常好的模式動物來評價藥物的效果。」

李曉江是美國Emory大學人類遺傳系教授，在神經退行性疾病領域做出許多重要成果，2010年入選為中組部「千人計劃」，2017年成為暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院教授。該研究院以暨南大學-香港大學腦功能與健康聯合實驗室為基礎，2012年正式成立。

亨廷頓舞蹈症是單基因突變導致的疾病　

亨廷頓舞蹈症、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化症等，是當今社會嚴重威脅人類健康的神經退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長而產生、可遺傳、呈漸進性發展，由於缺乏合適的動物模型進行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。

李曉江說，神經退行性疾病是致病蛋白變異後沉澱在神經細胞中，造成神經細胞功能紊亂，並引發神經細胞死亡，從而導致疾病發生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因（HTT）突變導致的神經退性疾病，是一個理想的疾病模式，可用於研究蛋白質錯誤摺疊如何引起選擇性的神經退性病變，為以後多基因突變病症研究提供基礎。

「夫妻檔」科學家與猴做朋友

小鼠作為最常見的動物模型，已被廣泛地用於研究人類疾病機理和尋找臨床治療方法。李曉江團隊在研究中發現，表達突變基因的神經退行性疾病小鼠模型，並不能表現出像病人腦中一樣的典型神經細胞死亡的重要病理特徵。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。為了探索動物模型，他開始把目光轉移到大動物、非人靈長類動物身上。

早在2008年，「夫妻檔」科學家李曉江、李世華在美國Emory大學合作者的支持下，通過將外源性的突變基因引入到獼猴的體內，成功地建立了世界首隻轉基因亨廷頓病猴模型。李曉江說，在該模型中，可以明顯地觀察到相應的病理特徵和行為變化，但表達外源性致病基因片段的毒性過強。實驗中的轉基因猴子基本上在出生後較短時間內死亡，同時無法傳代。因此轉基因亨廷頓疾模型無法達到篩選治療疾病的藥物的目的。

為何「二師兄」成為科學家的掌中寶?

?亨廷頓舞蹈症模型豬得到科研人員的嚴密呵護

位於廣州九龍鎮的「豬賓館」，科學家正精心飼養著一群身價不菲的實驗小豬。與果蠅、線蟲、小鼠等小動物相比，豬被公認為是人類醫學研究理想的大動物模型。

賴良學解釋道，豬的心血管系統、消化系統、皮膚、營養需要、骨骼發育以及礦物質代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習性允許科研人員進行反覆採樣和各種外科手術。

他還提到，與非人靈長類動物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產仔多，便於根據特殊需要進行選育，也不存在倫理學方面的問題。所以豬的疾病模型用於做藥物篩選、人類疾病研究、幹細胞治療的研究結果，更容易轉化為臨床應用。作為華南地區重要的大動物疾病模型實驗平台之一，賴良學團隊先後建立了50餘種在生物醫藥和農業領域具有重要價值的轉基因和基因打靶克隆豬。

2010年，這對「夫妻檔」找到了賴良學，他們一拍即合，合作建立了首例轉基因亨廷頓病豬模型。與猴模型一樣，豬模型也具有明顯的表型特徵，但不易存活、無法傳代。這一問題讓他們感到非常困惑，「人是在某個定點的基因突變而導致亨廷頓疾病，而目前轉基因技術是隨機地在體內基因組中插入外源性突變基因，其表達量也高於內源性致病因。」

大膽的設想：「基因魔剪」和克隆技術幫大忙

研究人員進而分析發現，亨廷頓舞蹈病是內源性基因突變而造成的，如果直接把豬的內源性基因改變為突變基因，豬的病理變化應該與病人的病理狀態更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大動物中很難獲得。2013年，隨著基因編輯技術CRISPR/Cas9被廣泛應用於哺乳動物中，在廣東省科技計劃的支持下，他們大膽嘗試這一科學設想，李世華著手應用Cas9技術建立亨廷頓基因敲入豬模型。

通過團隊通力的合作，他們利用CRISPR/Cas9技術，將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內源性亨廷頓基因的表達框中，即人外顯子1中包含150 CAG重複序列，精確地插入到豬的HTT內源性基因中。

但最終能否成功，還要看實驗的進展。研究者利用成纖維細胞篩選出陽性克隆細胞，事實上，這也並非易事。「單細胞逐個挑出來並進行篩選及鑒定，一定要挑選狀態最好的細胞用來胚胎移植」。負責此項實驗工作的閆森先後篩選了上千個細胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態最好的細胞，她說，「每天早上7點進入細胞間，看細胞、換液、不停地跟細胞打交道，一抬頭已是下午3點。好不容易篩選到的陽性克隆細胞如果狀態不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優的細胞克隆。」

「這的確是一個很大的工作量。」李曉江表示。除此之外，還遇到其他的困難，「當我們的F0代豬出生時，儘管數量比較多，但一開始沒經驗，由於群養爭鬥、搶食等因素，造成亨廷頓舞蹈症的模型豬死了不少，幸好還有兩隻存活下來，然後我們讓它們交配，產生F1代的豬，之後再產生F2的豬。第三個難點是，模型豬傳代也比較困難，只有穩定遺傳特定表型的豬，才是我們想要的。」

?正常的和患有亨廷頓症的豬模型行為比較

幸運的是，這項實驗順利地進入到下一步，他們運用體細胞核移植技術進行克隆，成功培育出帶有突變基因的新生豬。在歷經5個月的觀察後，亨廷頓豬出現了運動障礙等漸進性發病的表型。再進一步就是將穩定表達的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由於疾病模型豬身體狀態不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。在團隊的呵護下，最終這些亨廷頓舞蹈症模型豬生產出小豬。

為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特徵更接近於人類。李世華多次從美國返回國內指導實驗，到豬場看小豬的生存環境及生活狀態。至於模型豬能否很好地評估人類的亨廷頓舞蹈症，它與人的疾病癥狀有多相近？

李曉江就此對《知識分子》表示，「總體來說，還只能說是相近，兩個物種畢竟還是有種屬差別。但在很多方面，如豬的神經細胞死亡病理方面跟人非常相近，而小鼠沒有明顯的神經細胞死亡特徵。另外，小鼠的『舞蹈』行為很難體現出來，豬的這些行為跟人非常相似。此外，我們也發現，這些模型豬很多是因為呼吸衰竭而死亡，跟亨廷頓舞蹈症病人一樣，它們也因運動神經的死亡，容易引起肺炎，進而死亡，所以從豬的這些病理表型和行為，跟人更為接近。

小心求證：亨廷頓舞蹈症豬模型構建成功

?亨廷頓基因敲入豬紋狀體中明顯的神經元死亡

?紋狀體出現明顯的萎縮

實驗結果傳來，他們成功了。該模型不但能夠模擬亨廷頓症患者大腦紋狀體的神經元選擇性死亡的典型病理特徵，在行為上也表現出類似亨廷頓症「舞蹈樣」的異常行為。

更難能可貴的是，這些病理及行為學表型都可穩定地遺傳給後代。作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經病理變化特別是腦疾病方面，大動物模型比小動物模型更具優勢。

可為人類試藥，造福於人類

神經疾病基因敲入豬的成功，將推動我國發展出大動物疾病模型的醫藥研發產業鏈，促進針對阿爾茨海默病、帕金森症等神經退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新葯研發進程。同時，該動物模型可用於幹細胞治療等手段的臨床前評價，最終造福於人類。

從事多年研究亨廷頓病的資深專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東（X. William Yang）教授指出，亨廷頓舞蹈症基因敲入豬的建立是神經退行性疾病研究領域中一個里程碑式的發現，使科學家能更深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

非人靈長類動物模型是否會比豬模型會更好呢？今年1月25日，中科院神經科學研究所孫強等研究人員率先利用體細胞克隆出猴，備受外界關注，其中有一點是，未來這些克隆猴也會用來構建疾病模型。未來需不需要構建亨廷頓舞蹈症猴模型？李曉江表示，「目前亨廷頓舞蹈症猴模型還沒有，主要是由於基因敲入猴胚胎的效率太低。」但他同時表示，構建這一疾病的猴模型仍十分有意義，因為它在行為特徵表現上會比豬模型會更好，由此能更好地尋找有效的治療策略。

製版編輯：黃玉瑩 |

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