CAR-T在腫瘤治療中的研究進展，及發展機遇和挑戰

嵌合抗原受體(CAR)T細胞免疫療法來源於過繼性T細胞療法(ACT)，現在有三種形式的ACT用於癌症治療，包括：腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)；T細胞受體(TCR)T細胞；CAR T細胞。

得益於細胞工程技術的快速進展，使得嵌合抗原受體(CAR)T細胞免疫療法在腫瘤臨床中除頑固腫瘤外均取得了持久的臨床療效，表現出了巨大的潛力。更令人鼓舞的是，自體T細胞工程表達嵌合抗原受體(CAR)，CD19B淋巴細胞分子近期被FDA批准用於治療頑固性前-B細胞急性淋巴細胞白血病和擴散大B細胞淋巴瘤。

2018年3月23日在Science雜誌上發表的最新關於(CAR)T細胞免疫療法的綜述文章《CAR T cell immunotherapy for human cancer》。向我們著重介紹了CAR T細胞療法的前景、在實體瘤治療中的應用和在使用和商業化中出現的新差距等內容。本文將針對性探討當前CAR-T細胞療法在腫瘤研究中的進展、機遇和挑戰。

T細胞基因改造： TCR和CAR T細胞免疫治療的對比

圖1. T細胞基因改造：TCR和CAR T細胞的設計(圖片來源於參考文獻)

1. TCRs療法

TCRs包括一個α和β輕鏈與T細胞表面CD3複合物非共價結合。當TCR識別肽非共價結合抗原提呈細胞或腫瘤細胞表面的MHC時發生T細胞活化。先前開發的用於對抗轉移性黑色素瘤的TCR T細胞免疫療法，例如結合人淋巴細胞抗原A2 (HLA-A2)-來源於黑色素細胞分化抗原的限制肽的TCRs，以及具有更高親和力的TCR靶點MART-1的TCRs，儘管證明了療效有改善，但是也帶來了對皮膚、眼和耳蝸正常黑色素細胞的靶向損傷。但是有一半以上的治療患者卻可以避免上述腫瘤毒性，提示靶向共享抗原時，有效性與毒性之間的界線可能很狹窄。此外上述兩個TCRs療法伴隨著致死性神經和心臟毒性，與癌睾丸抗原MAGE-A3直接相關，這也進一步突出了面臨的挑戰。

然而目前正在進行晚期臨床評價的NY-ESO-1 T細胞療法(NCT01343043)似乎帶來了新的希望。癌睾丸抗原NY-ESO-1靶向表達T細胞則表現出更高的TCR親和力，特別是對HLA-A2限制肽，並且臨床療效明顯，無毒性反應。這讓我們重新燃起了希望—對於所有共享抗原靶點，治療窗口可能並不那麼狹窄。開發具有特定腫瘤新抗原特異性的TCR T細胞療法，可能比共享抗原的安全性更高，但是臨床上並未進行驗證。

2. CAR療法

CAR結合抗原結合域通常是來源於具有TCRζ鏈信號區域和包含如CD28、OX40和CD137等受體的附加共刺激區域的抗體的可變域的單鏈可變片段(scFv)。CARs克服了TCRs的一些限制，如需要MHC的表達、識別和共刺激等。CAR獨立於MHC識別限制的特性賦予了CAR T細胞抗腫瘤的有利基礎，因為大部分的腫瘤免疫逃逸機制均表明腫瘤細胞已經失去了MHC-相關的抗原提呈。當前CAR T細胞療法的一個限制就是它們需要識別腫瘤細胞的外表面靶點。

B細胞惡性腫瘤—CAR T細胞的意外收穫

在第一代CAR設計進行的臨床試驗中，對於多種腫瘤的治療結果均令人失望。2011年，第二代CAR T細胞靶向CD19和編碼共刺激結構域成為了T細胞基因改造方法治療腫瘤的模板。其特徵使得CD19成為幾乎理想的靶標。它顯示出在B細胞惡性腫瘤中的常見性和高水平表達，而且需要人體正常B細胞的發育，但是不表達B細胞系以外的細胞譜。採用CD19 CARs成功治療的患者通常表現出顯著的B細胞發育不良，因此CAR T細胞治療後的B細胞缺失，主要通過靜脈注射免疫球蛋白的替代療法進行改善。

早期關於CAR T細胞作用於其它靶點的試驗結果表明，CD19引發的非腫瘤交叉反應並非特例，但是可能在其它同系靶點中也觀察到相同反應。例如多發性骨髓瘤表達低水平CD19，採用CD19 CAR T細胞治療也有效。正在進行的CARs靶向B細胞成熟抗原(BCMA或CD269)的晚期骨肉瘤臨床試驗(NCT 02546167)中，除了惡性骨肉瘤細胞外，表達BCMA的良性漿細胞也被清除。非腫瘤反應的耐受程度主要依賴於靶向非癌細胞的類型。通過CD19-特異CAR T細胞療法，大部分白血病複發患者達到完全治癒，但也出現了兩種耐受類型。一類是缺失CART細胞靶向CD19抗原表位的急性白血病，導致腫瘤逃逸。全球臨床試驗中，CD-19陰性缺失變異的年輕和兒童急性白血病患者的複發率通常達到28%。另一類是慢性淋巴細胞(CLL)白血病，CLL的耐受可能是由於CART細胞注射後的增殖失敗。

CAR T在B細胞之外的應用

現今CAR T的應用已不僅僅局限於CD19。在早期靶向多發性骨肉瘤的BCMA和急性淋巴白血病的CD22的臨床試驗中，CAR T細胞療法均表現出相似的抗腫瘤活性。然而，正如CD19對B細胞系一樣，BCMA和CD22也存在著高度限制，其存在的組織會出現靶向毒性。迄今為止，靶向腫瘤相關抗原的嘗試取得的成功十分有限。

ERBB2/HER2蛋白作為酪氨酸激酶受體一員，在腫瘤中經常過表達，也是抗體或抗體-藥物偶聯治療的確證靶點。首次採用CAR T細胞靶向治療ERBB2/HER2患者時出現了致命性的毒性。通過使用具有基於赫賽汀和CD28和4-1BB細胞內信號傳導結構域的高親和力scFV的第三代CAR，揭示出毒性主要是由於識別和殺死肺上皮細胞表達低密度的ERBB2陽性細胞所致，引發肺衰竭和大量細胞因子釋放。含有scFv的較低劑量CAR T細胞療法較赫賽汀為基礎建立的CAR的親和力更低，治療骨肉瘤的安全性較好，但只有輕度的臨床活性。

靶向表達腎細胞癌碳酸酐酶IX (CAIX)抗原的第一代CART細胞療法在I期臨床試驗中也遇到了意想不到的肝毒性。原因是由於正常膽道上皮細胞CAIX抗原的低密度表達，並且在非臨床試驗中未發現該毒性。研究進一步表明該療法具有潛在的腫瘤抗原相關的靶向非腫瘤毒性。

在臨床試驗中，CARs靶向其它共享抗原相關實體瘤包括間皮素、癌胚抗原和GD2神經節苷脂時並未顯示出值得關注的毒性，但試驗中的臨床抗腫瘤療效也被限制到最低。GD2-特異CAR T細胞在臨床前試驗中隨著抗腫瘤活性的增強出現致死性神經毒性。局部注射靶向白介素-13受體α2的CAR T細胞治療多形性膠質母細胞瘤時未出現靜脈注射的預期毒性，表明需要關注一些抗原瘤內注射給藥方式。

腫瘤微環境是ACT成功治療的另一障礙，特別是實體瘤。抑制T細胞免疫的途徑，包括腫瘤免疫檢查點(如PD-L1的表達)，改變腫瘤代謝微環境(如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶的表達)，調節T細胞和抑制髓樣細胞。ACT治療後出現許多免疫和代謝檢查點增加，顯現出一定的耐受性。

聯合PD-1/PD-L1-抑制抗體和CD19特異CAR T細胞治療的臨床試驗正在進行(如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405)。除了聯合其他的免疫檢查點抑製劑，另一種治療方式，中斷抑制途徑如轉染受體或剪切基因也正在進行。

CAR T細胞療法的毒性

儘管ACT激活T細胞會導致一定程度的免疫刺激和炎症，但是CD-19特異性，BCMA特異性和CD-22特異性CAR T細胞均觀察到嚴重的細胞因子釋放併發症(CRS)。該癥狀較TIL-和TCR療法常見的流行性感冒樣併發症更加嚴重。CAR T細胞引發的CRS嚴重程度與腫瘤負擔相關。在大部分嚴重型患者中，CRS多數表現為嗜血細胞性淋巴組織細胞增多症和巨噬細胞活化綜合征的特徵。

圖2 CAR T細胞治療伴隨細胞因子釋放併發症和神經毒性(圖片來源於參考文獻)

儘管CRS是T細胞免疫療法的預期毒性，但是在臨床試驗中仍觀察到CD19和BCMA特異性CAR T細胞治療中出現的輕度到重度的神經系統癥狀。發生T細胞免疫療法介導的CRS和腦水腫的作用機制仍不太明確，部分原因是因為缺少有說服力的動物模型來探討重要毒性的發生機制。

通過基因工程完善T細胞基因改造

與TCRs相似，親和力改變也適用於CAR的設計中，以便增加CART細胞潛在的抗腫瘤能力和調節靶點的非腫瘤毒性。然而，選擇最佳的親和力也是需要反覆調整的，例如臨床前試驗模型表明抗腫瘤活性的改善(但是出現嚴重的神經毒性)與增強GD2-特異CAR結合力密切相關。

除了親和力，最重要的還要評價CAR的胞外結構域、跨膜區和信號傳導這些能改變CAR功能的影響因素。但不幸的是，幾乎沒有限定的標準可尋，CAR的設計絕大部分仍然是經驗性的。許多案例顯示，在非臨床試驗中不能完全體現出所有的有效性和安全性，這就使得CAR的設計更加複雜化。

通用型CAR T細胞

儘管ACT是從異基因骨髓移植演變而來。但由於MHC所固有的障礙，ACT策略集中於自體T細胞。如果MHC的屏障清除，那麼異體捐獻或「通用型」T細胞會較自體T細胞更能發揮更好的療效。源自健康供體的通用型CAR T細胞具有克服與腫瘤治療相關的免疫缺陷的潛力。此外，通用CAR T細胞療法的使用可能為簡化工程細胞製造提供了機會，甚至允許生產「現成」ACT產品。與自體患者特異性T細胞相比，促進更快速和更便宜的治療。

然而，主要的問題仍然是該方法是否能單用發揮療效，或僅作為現今確證療法如幹細胞移植或者自體CAR T細胞治療的橋接作用。

基因編輯和多功能CARs

多種方法均能靶向破壞DNA雙鏈，達到插入或切除突變位點，使靶基因失活的作用。同源直接修復可用於在靶位點插入目標基因。有許多基因編碼工具，包括鋅指核酸酶、大範圍核酸酶、TALENs、複位內切核酸酶及CRISPR-Cas9核酸酶。這些技術已經成功應用於T細胞工程。現在該領域的主要問題是細菌衍生的Cas9是否具有足夠的免疫原性以干擾CRISPR-Cas9編輯的T細胞遞送。

人類基因編碼給清除免疫抑制提供了機遇，例如能清除CTLA-4和PD-1等的免疫抑制，增強T細胞功能，並可以避免免疫檢查點相關的毒性反應。基因編碼也被用於清除CAR的靶向基因，可能有利於靶向腫瘤相關抗原，有利於T細胞的腫瘤免疫。

CAR T細胞的商業化

在過去幾十年里，腫瘤免疫領域作為一個成功的故事被廣泛關注。然而，大多數通常都是非治癒的靶向治療，能夠延長生病和增加癌症患者的生存率。現在有250多項CAR T臨床試驗正在進行。值得關注的是，這些臨床試驗存在地域差異，熱衷於該研究的區域主要有中國、美國，較少的試驗在歐洲、日本和南半球(圖4)展開。

圖4 CAR T細胞療法臨床試驗的地域分布

對於有夠有效治療但不能治癒的血液惡性疾病，特別是慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和多發性骨髓瘤，患者的經濟負擔在明顯增加。美國最常見的白血病CLL，在2000年時大約有10萬例患者，由於使用改善但不能治癒的靶向療法，例如Ibrutinib和Idelalisib，預計美國將增加至約20萬例患者。靶向治療CLL目前不但對個人，而且對整個社會經濟都已成為重要的經濟負擔。現在估計每例患者整個生命周期約花費60萬美元，到2025年美國僅CLL治療整體花費將超過50億美元。CAR T細胞療法較現今的標準治療白血病和淋巴癌的方法花費更高。生產的高度個性化T細胞需要更大的費用，因此迫切期待降低CAR T細胞的生產成本。

未來的機遇和應用

我們值得從多個角度關注治療白血病和淋巴癌的CAR T細胞療法，更重要的是CAR T細胞療法是美國FDA首次批准的商業化基因轉染療法。由於CAR T細胞具有CRS風險和神經毒性，需要隨時進行風險評估和處置方案設計，因此FDA要求醫師完成不良反應處置的培訓。

開發細胞療法的最大挑戰是，由於缺乏非臨床試驗資料，導致不能有效評估項目的安全性和有效性，不能預見早期臨床試驗中可能遇到的安全性問題。儘管CAR T細胞療法對於治療血液惡性腫瘤的表現良好，但在實體瘤治療中仍存在許多障礙。

CART研究中的T細胞設計、基因編碼和細胞生產都是T細胞療法潛在的負擔。採用T細胞方法作用於其它細胞對於腫瘤免疫以外的其它疾病，如感染、器官移植和自身免疫疾病均有廣闊的研發前景。

參考文獻

Carl H. June et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science.2018, 359, 1361–1365