世界首例神經疾病基因敲入豬在中國誕生

在廣州九龍鎮有一座 「豬賓館」，生活著一群身嬌肉貴的實驗小豬，他們能精準地模擬人類的疾病。科學家利用基因「剪刀」 CRISPR-Cas9，精準地把人突變的亨廷頓基因「粘貼（敲入）」到豬的亨廷頓基因中，從而使豬得了亨廷頓舞蹈病。

廣東科學家領銜的國際研究團隊經過四年努力，首次利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9）和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入豬，精準地模擬出人類神經退行性疾病。

實驗動物基地「豬豬賓館」

該項成果於北京時間3月30日在線發表在生物學頂尖學術期刊《細胞》上，該研究為開發治療亨廷頓舞蹈病的新手段提供了穩定、可靠的動物模型，也為培育其它神經退行性疾病大動物模型提供了技術範本和理論依據。研究將推動我國發展出大動物疾病模型的醫藥研發產業鏈，也可用於幹細胞治療等手段的臨床前評價，最終造福於人類。

中科院院士裴鋼教授在得知該成果發表後指出，2008年，我們在制定發育與生殖研究國家重大科學研究計劃"十二五"專項規劃時,就前瞻性地布局了大型實驗動物模型包括豬和猴的培育內容,並在後來的「幹細胞國家重大科學研究計劃」中持續加大經費投入。我國在基因編輯猴和克隆猴的研究中相繼取得突破性成果，這次我國科學家在豬的疾病模型研究中又取得重大進展，表明我國在大動物模型的研究中已走在世界前列，將極大地推動我國生物醫藥產業的創新發展。

論文共同通訊作者為暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院李曉江教授、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院賴良學研究員、美國Emory大學李世華(Shihua Li)教授。

什麼是亨廷頓舞蹈症

亨廷頓舞蹈症、阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側索硬化症等是當今社會嚴重威脅人類健康的神經退行性疾病。這些疾病伴隨年齡漸長而產生、可遺傳、呈漸進性發展，由於缺乏合適的動物模型進行藥物篩選，目前尚無有效的治療方法。

李曉江介紹，神經退行性疾病是致病蛋白變異後沉澱在神經細胞中，造成神經細胞功能紊亂，並引發神經細胞死亡，從而導致疾病發生。而亨廷頓舞蹈病是由單基因（HTT）突變導致的神經退性疾病。這是一個理想的疾病模式，可用於研究蛋白質錯誤摺疊如何引起選擇性的神經退性病變，是以後研究多基因突變病症的基礎。

尋找合適的疾病實驗模型

小鼠作為最常見的動物模型，已被廣泛地用於研究人類疾病機理和尋找臨床治療方法。李曉江團隊在研究中發現，表達突變基因的神經退行性疾病小鼠模型，並不能表現出像病人腦中一樣的典型神經細胞死亡的重要病理特徵。許多有治療效果的藥物在小鼠模型中有效，在臨床上對病人往往無效。為了探索動物模型，他開始把目光轉移到大動物、非人靈長類動物身上。

早在2008年，「夫妻檔」科學家李曉江、李世華在美國Emory大學合作者的支持下，通過將外源性的突變基因引入到獼猴的體內，成功地建立了世界首隻轉基因亨廷頓病猴模型。李曉江說，在該模型中，可以明顯地觀察到相應的病理特徵和行為變化，但表達外源性致病基因片段的毒性過強。實驗中的轉基因猴子基本在出生後較短時間內死亡，同時無法傳代。因此，轉基因亨廷頓病猴模型無法達到篩選治療疾病的藥物的目的。

為何選擇豬

位於廣州九龍鎮的「豬賓館」，記者看到，科學家們正精心飼養著一群身價不菲的實驗小豬。與果蠅、線蟲、小鼠等小型動物相比，豬被公認為是人類醫學研究理想的大動物模型。賴良學解釋，豬的心血管系統、消化系統、皮膚、營養需要、骨骼發育以及礦物質代謝等都與人的情況極其相似，豬的體型大小和馴服習性允許進行反覆採樣和進行各種外科手術。

賴良學提到，與非人靈長類動物相比，豬的基因多樣、繁殖周期短、一窩產仔多，便於根據特殊需要進行選育，又不存在倫理學方面的問題。所以，豬的疾病模型用於做藥物篩選、人類疾病研究、幹細胞治療的研究結果，更容易轉化為臨床應用。

作為華南地區重要的大動物疾病模型實驗平台之一，賴良學團隊先後建立了20餘種在生物醫藥和農業領域具有重要價值的轉基因和基因打靶克隆豬。2010年，這對「夫妻檔」找到了賴良學，一拍即合，他們合作建立了首例轉基因亨廷頓病豬模型。

「豬八戒」成為科學家掌中寶

大膽的科學設想

擺在科學家面前的是一個難題，與轉基因亨廷頓病猴模型一樣，豬模型也具有明顯的表型特徵，但不易存活，無法傳代。這一問題，曾一度令他們感到非常困擾。李世華說，「人是在某個定點基因突變而導致亨廷頓疾病，而目前轉基因技術是隨機性的將外來的變異基因插入動物的基因組，其表達量也高於內源性致病基因。」

團隊進而分析，直接把豬的內源性基因改變為突變基因，豬的病理變化應該與病人的病理狀態更接近。然而，基因敲入的效率太低，在大動物中很難獲得。2013年，隨著基因編輯技術（CRISPR/Cas9）被廣泛應用於哺乳動物中，在廣東省科技計劃的支持下，他們大膽嘗試這一科學設想，李世華著手應用Cas9技術來建立亨廷頓基因敲入豬模型。團隊通力合作，利用基因編輯技術（CRISPR/Cas9），將人突變的亨廷頓基因插入到豬的內源性亨廷頓基因的表達框中，即人外顯子1中包含150 CAG重複序列精確地插入豬的HTT內源性基因中。

能夠成功關鍵還看實驗進展，利用成纖維細胞篩選出陽性克隆細胞，這並非一件易事，「單細胞逐個挑出來並進行篩選及鑒定，一定要挑選狀態最好的細胞用來胚胎移植」。負責此項實驗工作的閆森先後篩選了上千個細胞，從中挑出確定帶有突變基因且狀態最好的細胞，閆森說，「每天早上7點進入細胞間，看細胞、換液、不停地跟細胞打交道，一抬頭已是下午3點。好不容易篩選到的陽性克隆細胞如果狀態不好又得重來，只有大量篩選才能獲得最優的細胞克隆。很快，實驗進入下一步，他們運用體細胞核移植技術進行克隆，成功培育帶有突變基因的新生豬。在歷經5個月的觀察後，亨廷頓豬出現了運動障礙等漸進性發病的表型。下一步就是將穩定表達的基因敲入亨廷頓豬繁殖下去。由於疾病模型豬身體狀態不好，在傳代過程中更需要悉心的照料。終於在團隊的呵護下F1代小豬出生了。為了證明亨廷頓基因敲入豬的病理特徵更接近於人類。李世華多次從美國返回國內親自指導實驗，到豬場看小豬的生存環境及生活狀態。

小心的求證

實驗結果傳來，他們成功了！其結果驗證，該模型不但能夠模擬亨廷頓病患者在大腦紋狀體的神經元選擇性死亡的典型病理特徵，在行為上也表現出類似亨廷頓病「舞蹈樣」的異常行為。難能可貴的是，這些病理及行為學表型都可以穩定地遺傳給後代。

作為世界首例亨廷頓病豬基因敲入模型，它表明在模擬病人的神經病理變化特別是腦疾病方面，大動物模型比小動物模型更具優勢。

「豬八戒」成為科學家掌中寶

為人類試藥 造福於人類

神經疾病基因敲入豬的成功，將推動我國發展出大動物疾病模型的醫藥研發產業鏈，促進針對阿爾茨海默病、帕金森症等神經退行性疾病，以及免疫缺陷、腫瘤、代謝性疾病的新葯研發進程。同時，該動物模型可用於幹細胞治療等手段的臨床前評價，最終造福於人類。

從事多年研究亨廷頓病的權威專家、美國加州大學洛杉磯分校楊向東(X. William Yang)教授指出，亨廷頓舞蹈病基因敲入豬的建立是神經退行性疾病研究領域中一個里程碑式的發現，使科學家能更深入了解神經細胞死亡的機制及尋找有效的治療方法。

文章共同第一作者為暨南大學粵港澳中樞神經再生研究院閆森副研究員和塗著池博士、中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院劉朝明。中山大學、吉林大學、雲南農業大學的科學家們也參與了該工作。研究工作得到了國家自然科學基金委、國家重大研究計劃、國家重點研發計劃以及廣東省科技計劃的大力支持。

來源：中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院、暨南大學