可檢10毫升血漿中的病毒！新型生物感測器讓HIV病毒無處遁形

近日，來自西班牙國家研究中心（Spanish National Research Council，CSIC）的團隊開發了一款能夠在感染後一周內檢測1型艾滋病毒HIV的新型生物感測器技術。該實驗在人體血清中開展，檢測目標是p24抗原，即一種存在於HIV-1病毒上的蛋白。這項新技術，已獲得了專利，檢測p24蛋白的能力比現行方法強10萬倍。另外，總檢測時間只需4小時45分鐘 - 這意味著臨床測試的結果可以在當天獲得。

目前,HIV感染之後的早期檢測是阻止疾病快速傳播和提高抗逆轉錄病毒治療效果的最佳方式。基於核酸擴增的檢測技術（Nucleic acid amplification tests，NAAT）已成為檢測血液中低濃度病毒的金標方法。但是，這些方法需要較高的實驗技術和較大的成本，限制了在發展中國家的普及。相對而言，基於免疫的分析方法成本低，也更加適用於即時診斷（point-of-care diagnosis，POCT）的需求。然而，它們的檢測靈敏度往往過低。

而本研究就創新性地開發了基於納米機械臂和光機械傳導的三明治免疫感測器，通過兩個簡單步驟即可特異性檢測人類血清樣本中的p24抗原，檢測限可達10?5 pg/mL，這相當於可以檢測到10毫升血漿中的單個病毒，檢測能力比現行免疫法提高了5個數量級（十萬倍），比NAAT方法提高了2個數量級。

該研究的技術可以追溯到2014年，該團隊在《Nature Nanotechnology》上發表題為「Detection of cancer biomarkers in serum using a hybrid mechanical and optoplasmonic nanosensor」的文章，系統闡述了這種結合納米機械臂和光學等離子效果的雙感測機制。限於篇幅本文不再贅述，感興趣的讀者可以詳細參考該文章：

http://www.nature.com/nnano/journal/v9/n12/pdf/nnano.2014.250.pdf

那麼，這種先進的生物感測器是如何工作的呢？如圖1 所示，該感測器同時採用了微納機械硅結構（微納懸臂樑技術）和金納米顆粒。首先，微納懸臂樑和納米金都特異性地修飾上p24抗體。隨後，經過一定的免疫反應步驟，p24、微納懸臂樑、納米金形成三明治結構。金納米顆粒具有光學等離子共振效應，能夠很有效地散射光線，已成為近十年來最引人關注的納米材料之一。微納懸臂樑，又稱微納機械臂，是出色的微米甚至納米維度的機械感測器，他們具有檢測分子間作用力的能力。這兩種技術的結合的感測器，既可產生機械信號，又可產生光學信號，相互之間相互放大，顯著增強了感測器的靈敏度。

圖1 p24抗原三明治免疫感測器的檢測機理示意圖

圖1中，懸臂樑的上表面修飾了1型HIV病毒p24抗原的特異性抗體。懸臂樑的下表面修飾了一層「保護層」，可將非特異性吸附最小化。檢測時，將懸臂樑浸入人體血清樣本中並經過簡短的孵育，使得抗體去捕獲p24抗原至懸臂樑表面。然後用緩衝液清洗被測物，再加入標記有檢測抗體的納米金標溶液（直徑為100 nm），即可進行光學和機械性能的檢測。

圖2 硅基懸臂樑的掃描電鏡圖

圖2展示了該感測器的懸臂樑的掃描電鏡圖。從圖中清晰可見懸臂往外伸出，有序排列。

圖3 對免疫複合物的納米機械傳導和光學等離子傳導示意圖

圖3（a）表明通過檢測光路的偏轉，從而間接檢測微懸臂樑的振動的方法。一束激光聚焦在懸臂樑的自由末端。位於懸臂樑下方的壓電制動器驅動著懸臂樑。光束由於懸臂樑的振動而發生偏轉（反射），而這樣的偏轉信號最終由靈敏的位置探測器記錄。（b）硅基懸臂樑在三個振動模塊下，免疫反應前（虛線）後（實線），含目標物濃度5*10-4 pg/mL的血清樣本和不含任何目標物的血清樣本（空白對照）的振動頻譜圖。（c）示意圖展示了結合到懸臂樑表面的金納米顆粒對於光散射的多種途徑。（d）（b）中免疫反應後，微懸臂樑的暗場光學分析圖像，及其局部方法圖像。

圖4 對不同濃度的血清樣本進行檢測結果圖

圖4是本研究對不同目標物濃度的血清樣本進行光學檢測和懸臂樑機械檢測的結果圖。上圖是前文中三種振動模式下，從微懸臂樑振動頻率的變化而得到的質量的變化（增加的質量）。下圖是免疫反應後，從暗場光學圖像分析得到的光學散射信號。圖中大的圓點和實線表示每個濃度下目標物的平均值和標準偏差，虛線代表空白檢出限。

圖5 檢測性能分析比較圖

圖5（a）是在95%置信區間下，光學信號和納米機械信號超出空白檢出限的可能性大小，由此可以評估該感測器的最低檢測限，也即10-17 g/mL。（b）是對感染HIV病毒後五周內的病毒攜帶量檢測結果。本文的光機械感測器法（optomechanoplasmonic method，OMP）、核酸擴增法（nucleic acid amplification testing methods，NAAT）以及第四代免疫分析法（the fourth-generation immunoassays，4th G EIA）的檢測限的比較。由此可見，本研究的方法檢測能力比免疫法提高了5個數量級，比NAAT方法提高了2個數量級。

本研究給HIV檢測技術帶來了深遠的意義。它結合兩種前沿的分析技術，在已有技術基礎上，將艾滋病檢測的檢測限提高了多個數量級，實現了超靈敏的分析。而且，本技術具有成本低，操作簡便，利於製作小型化檢測設備等其它優勢。由於HIV病毒的早期感染性比後期的高很多，因此這項可以實現超靈敏早期診斷艾滋病的研究，可縮短艾滋病感染後的發現周期至一周內，從而也對提高對艾滋病治療的效果以及阻止艾滋病的擴散都至關重要。

目前，CSIC的這項專利技術也被用於癌症的早期檢測。位於馬德里微電子研究所的CSIC研究人員Javier Tamayo表示，「不管是檢測HIV還是癌症生物標記物，該感測器的物理元件部分是不變的。而變化的是它的化學部分—即我們所添加的溶液不同，反應基於我們所需要尋找的對象。因此，我們的基本工作集中在開拓這項新技術的應用範圍。」 他還表示，該生物感測器用到的結構是很成熟的微電子技術生產的，這使得大批量製備和降低生產成本成為了可能。再加上其簡便性，因此在發展中國家會有較大市場。

參考資料：

https://www.technologynetworks.com/diagnostics/news/rapid-type-1-hiv-nanosensor-100000-times-more-sensitive-than-current-tests-285063

Priscila M. Kosaka, Valerio Pini, Montserrat Calleja and Javier Tamayo. Ultrasensitive detection of HIV-1 p24 antigen by a hybrid nanomechanical-optoplasmonic platform with potential for detecting HIV-1 at first week after infection. PLOS ONE.

Kosaka, P. M.; Pini, V.; Ruz, J.; Da Silva, R.; González, M.; Ramos, D.; Calleja, M.; Tamayo, J., Detection of cancer biomarkers in serum using a hybrid mechanical and optoplasmonic nanosensor. Nature Nanotechnology 2014, 9 (12), 1047-1053.

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