讀文獻 | 神經元樣分化的SH-SY5Y細胞適應溫和短暫H2O2誘導的氧化應激

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題目：神經元樣分化的SH-SY5Y細胞適應溫和短暫H2O2誘導的氧化應激

Title：Neuronal-like differentiated SH-SY5Y cells adaptation to a mild and transient H2O2 -induced oxidative stress

導讀

實驗結論：

1.神經元樣分化的SH-SY5Y細胞對H2O2誘導的氧化應激敏感，且細胞在100μM濃度以下H2O2處理24h內可刺激PC反應對抗氧化應激；

2.這種細胞類型可以作為一種合適的體外模型來進一步關注PC反應；

3. 由於PC在神經元樣分化的SH-SY5Y凋亡和炎症途徑的細胞保護中起重要作用，氧化損傷的發展，在體內與衰老和缺血後腦損傷相關。 因此，這些結果可能有助於為藥物治療提供一個思路，希望能夠開發靶向涉及這種內源性神經保護策略的信號轉導途徑。

研究背景

過氧化氫誘導的氧化應激產生的活性氧(ROS)， ROS是一種普遍存在的自由基，被認為是細胞功能和信號的生理標誌。ROS的產生與內源性抗氧化系統清除ROS之間的不平衡導致氧化應激，導致與年齡相關的疾病，如神經退行性疾病、癌症和糖尿病，以及缺血/再灌注後繼發性損傷的發展。

預適應（PC）是1986年美國學者穆里（Murry CE）等提出的，他們在研究犬心肌缺血模型時，發現阻斷冠狀動脈5分鐘再灌注5分鐘，反覆4次之後可使再阻斷冠狀動脈40分鐘所致的心肌梗死範圍比對照組減少75%。這種保護性反應，被認為是一種內源性的適應性保護機制，以應對短暫的亞循環缺血和間歇性再灌注，從而產生更有效的保護機制。

體外預適應的方法是在輕度和短暫的氧化應激後施加長期的氧化條件，這種氧化應激可能是機械性的(熱休克、拉伸、超聲、激光輻射或磁場)，也可能是生物的(缺氧和營養缺乏或低濃度過氧化氫(H2O2)的氧化應激)。

研究目的

由於預適應對神經細胞涉及多種尚未完全了解的保護機制，本研究的目的是驗證神經母細胞瘤SH-SY5y細胞所獲得的神經元樣分化細胞，與其他神經細胞相比，能否適應輕度和短暫的H2O2誘導的氧化應激，從而產生PC反應，對抗氧化應激產生有害作用。

通過監測細胞活力、細胞大小、凋亡(Bcl-2、Bad)和炎症(INOS)通路以及抗氧化系統(MnSOD)來確定最低H2O2濃度。其目的還在於確定H2O2濃度的上限和保護濃度，因為保護時間的持續與信號通路的激活在體內缺血發作後pc反應中起著關鍵作用。

實驗內容

1.SH-SY5Y細胞培養及MTT測定H2O2處理細胞後的細胞活性

a.用含10% 胎牛血清, 1% 雙抗, 1mM丙酮酸鈉, 2mM L‐谷氨醯胺的 MEM/Ham『s F‐12 培養基培養，每兩天換液，保證所有細胞培養條件一致。

b.用含有1%胎牛血清的完全培養基重懸細胞，按4 × 10 4 個細胞接種到96孔板中，孵育24h。用維甲酸(100 nM)誘導細胞分化，一旦細胞分化 ，加H2O2處理。

2.PC實驗

MTT測定細胞被低濃度H2O2(10μM-50μM)預處理6小時或24小時，然後用較高濃度的H2O2(100μM~300μM) 作用24小時後細胞活性。

實驗分組如下：

a.對照組(CTR)：分化細胞，不加H2O2刺激； ·

b.10μM H2O2 PC組：10μM處理的分化細胞前6或24小時後H2O2(100μM或 200μM或300μM H2O2)在作用24h；

c.20μM H2O2 PC組： 30μM H2O2 PC組； 50μM H2O2 PC組。

左圖為正常形態；右圖為分化的細胞形態

維甲酸作用後，細胞由原來的三角形或者多角形形態轉變為具有較長的細胞突起的形態。

3.細胞大小測定

製備細胞切片，在光學顯微鏡下測量細胞大小。每組實驗至少測量30個，求平均細胞大小。

4.Western blot 測定相關蛋白的表達水平

Western blot測定Bcl-2（抗凋亡）、 Bad（促凋亡）、 iNOS and MnSOD（炎症路徑）的表達量。

實驗結果

1.H2O2處理對細胞活性的影響：

實驗結果：不同H2O2濃度（10μM~300μM）分別處理細胞2h、6h、24h後檢測細胞活性。在處理細胞2h 、6h時H2O2對細胞活性沒有影響，處理24h，高濃度的H2O2（100μM~300μM）對細胞活性劑量-時間依賴性作用。

低濃度的H2O2（ 10μM~50μM）在處理細胞6h、24h沒有誘發細胞死亡，可作為預適應的H2O2濃度。

2. PC實驗結果：

實驗結果：

(1). 高濃度H2O2單獨處理組與對照組相比，細胞活性顯著降低；

(2). 不同劑量低濃度H2O2預處理6h後，高濃度H2O2處理24h，細胞與高濃度H2O2單獨處理組相比，細胞活性沒有顯著變化；

(3).不同劑量低濃度H2O2預處理24h後，隨後200μM和300μ H2O2處理24h，細胞與高濃度H2O2單獨處理組相比，細胞活性沒有顯著性差異，而100μM處理的細胞，細胞活性有所提高。

鑒於以上結果，預適應低濃度H2O2 （10μM~30μM）處理24h後100μM H2O2處理24h還有更深的研究。

3. 預適應對細胞大小的影響：

圖註：預適應處理24h(10μM~30μM)後，100μM H2O2處理1h(A)、6h(B)相對正常組細胞大小；正常組（C）； 100μM H2O2單獨處理6h（D）；10 μM H2O2處理24h後100μM H2O2處理6h（E）。

實驗結果：

(1).100μM H2O2單獨處理細胞1h或者6h，與對照組相比，細胞大小顯著降低；(2).預適應處理細胞24h後， 100μM H2O2在處理1h或者6h，與100μM H2O2單獨處理組相比，細胞大小顯著增加，而與正常組相比沒有太大變化。

(3).預適應處理細胞24h後， 100μM H2O2在處理24h細胞大小不能確定，細胞損傷後形態顯著變化。

4. Bcl-2和Bad蛋白的表達:

實驗結果：

(1).用10μM或20μMH2O2單獨處理細胞24小時與未處理的細胞相比Bcl-2、 Bad表達水平沒有顯著變化，而30μMH2O2處理Bcl-2表達水平降低， Bad表達水平升高（數據未顯示）；

(2).100μM H2O2單獨處理細胞，Bcl-2表達水平降低， Bad表達水平升高；

(3).用10μM或20μMH2O2預處理後用100μM H2O2處理後， Bcl-2表達水平較100μM H2O2單獨處理組顯著增高，與正常組相比差異不大，而30μMH2O2預處理組與100μM H2O2單獨處理組相比， Bcl-2表達水平沒有顯著差異，而低於正常組；

(4).10μM H2O2預處理組較100μM H2O2單獨處理組，Bad水平明顯下降， 20μM 和30μM H2O2預處理組與正常組相比， Bad水平明顯上升。

5. iNOS and MnSOD蛋白的水平:

實驗結果：

(1).用10μM或20μMH2O2單獨處理細胞24小時與未處理的細胞相比、 iNOS水平沒有顯著變化，而30μMH2O2處理. iNOS表達水平升高（數據未顯示）；

(2). 100μM H2O2單獨處理組iNOS表達水平明顯高於對照細胞，也高於10μM H2O2預處理組；與20μM 和30μMH2O2預處理組表達相當。

(3).處理組與對照組相比，MnSOD蛋白水平沒有沒有顯著性差異。

實驗討論

1.本研究的目的是驗證神經元樣分化的SH-SY5Y細胞是否能適應輕度和短暫的H2O2誘導的氧化應激，從而產生PC反應，對抗氧化應激的有害作用。 H2O2可能根據細胞靶點及其濃度範圍表現出多種效應，因此，第一個目標是選擇溶解濃度來誘導損傷，而不是選擇溶解濃度來刺激PC反應。

2. 細胞形態學監測進一步證實了神經元樣分化的SH-SY5Y細胞對氧化應激的適應。 H2O2作用後的細胞收縮是細胞凋亡的標誌，由離子通量激活介導。由於PC反應參與了神經元樣分化的SH-SY5Y細胞大小的恢復，因此可以合理地考慮離子傳導在適應過程中的作用以及在腦卒中和腦外傷中的藥理靶向作用。

3.細胞凋亡和炎症途徑在一腦缺血或創傷性腦損傷後繼發損傷起關鍵作用。

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