非小細胞肺癌EML4-ALK靶向藥物機制及逆轉耐葯

1、概述

肺癌是目前世界上最常見的惡性腫瘤之一,居惡性腫瘤死亡率之首。在我國,肺癌的死亡率呈逐年增加的趨勢,是人群死亡率上升最快的癌症。基於肺癌的生物學特性和臨床病理特徵,WHO將其分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC) 和小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC) ,其中NSCLC比例高達85%。

圖1 鱗癌:分化較差,角化不明顯,細胞呈巢狀分布,胞核增大、深染,核質比增大  

圖2 透明細胞癌:癌組織呈實性片狀生長,間質較少,胞質透亮  

圖3 腺癌:癌細胞呈柱狀或釘突樣襯覆於肺泡表面,核位於頂端,肺泡腔內可見脫落的癌細胞  

圖4 小細胞癌:癌細胞呈不規則實性片狀生長,細胞小,胞核明顯深染,胞質稀少

約有2/3左右NSCLC患者就診時都已不能手術治療,對於這些患者,單純的放療或者化療的治療效果都不理想。靶向藥物作為一種新型治療藥物,具有更強的針對性,能夠增強對腫瘤細胞的殺傷力和減少對正常細胞的毒副作用,成為NSCLC藥物治療的研究熱點,如EGFR和K-Ras等。

以下是針對非小細胞肺癌的靶向葯匯總:

2、EML4-ALK融合基因的結構以及臨床病理特徵

非小細胞癌中ALK的融合基因有KIF5B-ALK(kinesin family 5B-anaplastic lymphoma kinase),TFG-ALK(TRK-fused gene-anaplastic lymphoma kinase),NPM-ALK(Nucleophosmin-anaplastic lymphoma kinase)和EML4-ALK等。

這其中最主要的還是融合還是發生在EML4和ALK的融合上,在融合位點上有多種形式。鑒別ALK與其他基因是否發生重排的金標準是FISH,也就是免疫熒光原位雜交。它的原理是使用紅色熒光探針標記ALK基因的前面,使用綠色熒光探針標記ALK 基因的後面,一般正常的ALK基因,這兩種熒光在一塊,疊加顯示出黃色的熒光信號。而如果ALK與其他基因發生了融合,則在顯微鏡下可以看到紅色熒光和綠色熒光的分離,一般100個細胞數,超過15個就認為是陽性。

EML4-AL融合基因由日本學者Soda等在1例62歲吸煙肺腺癌患者手術切除標本中首次發現。EML4基因主要維持細胞的基本形態,而ALK基因能夠激活和促進細胞增殖,EML4基因的5』端與ALK基因的3』端易位融合,EML4激活ALK酪氨酸激酶區從而導致細胞的惡性增殖,引起癌變。EML4和ALK兩個基因序列在2號染色體短臂上(2p21和2p23)發生融合,兩者相隔12Mb,融合時須兩者之一反向與對方相接。EML4-ALK融合基因由於斷裂相接的位置不同存在多種亞型,EML4基因有很多斷裂點,而ALK只有跨膜結構N端這一個融合位點,這些亞型中大多數都能夠促進腫瘤形成。融合變異體對EML4-ALK抑製劑表現出不同的敏感性。

EML4-ALK陽性患者的臨床特徵為年輕、不吸煙或輕度吸煙史及腺癌。EML4-ALK融合基因存在於多種實體瘤中,但在NSCLC中檢出率最高。以往報道EML4-ALK融合基因陽性的肺癌患者,通常不伴有EGFR和K-Ras基因突變。基於此,臨床上NSCLC的治療先進性K-Ras檢測和EGFR檢測,兩者都為陰性的前提下再進行ALK突變的檢測。然而近年來也有研究發現,部分EML4-ALK融合基因陽性的NSCLC患者產生耐葯後會出現EGFR突變或者K-Ras突變。

3、EML4-ALK融合基因的檢測方法

上圖為通過免疫組化染色檢測ALK蛋白表達在四例腺癌中的情況。

A) ALK完全負染色;

B) 強(3+)染色ALK;

C) 強(3+)染色ALK;

D) 中度染色(2+)ALK;

目前,檢測EML4-ALK融合基因的方法有很多種,其中原位雜交法中得熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization,FISH)為FDA認可的檢測方法,但此方法無法同時觀察病變組織的形態結構。

而顯色原位雜交法(chromogenic in situ hybridization,CISH)具有與FISH一致的檢測敏感性、特異性及準確性,可以保留腫瘤組織的結構和形態,彌補了FISH無法觀察組織學形態的不足。

免疫組織化學法(immunohistochemistry,IHC)是常規病理檢測的主要方法,價格便宜,但靈敏度低,不能完全代替FISH方法來檢測ALK基因的重排,可以作為基因的初步篩查方法。

RT-PCR方法檢測EML4-ALK融合基因亞型的鑒別,但該方法需要高純度的RNA,臨床上病理組織由石蠟包埋,長時間放置會出現RNA降解,因此進行RT-PCR檢測時最好用新鮮的肺癌組織。另外,EML4-ALK融合基因亞型比較多,需要設計多組引物。

上圖為採用RT-PCR方法檢測EML4-ALK易位研究,顯示了2種變異情況

當然,新一代測序技術也是可以用於EML4-ALK的檢測的。

3、非小細胞肺癌中針對ALK靶向藥物及耐葯機制簡述

作用於ALK的相關靶向藥物如下表所示:

由輝瑞公司研製的克唑替尼(PF02341066)是一種口服的小分子ATP競爭性的c-MET(hepatocyte growth factor)和ALK抑製劑,選擇性的抑制ALK基因易位,使酪氨酸激酶磷酸化水平下降,阻斷下游細胞增殖、遷移,在臨床上用於非小細胞肺癌的一線治療。

EML4-ALK融合基因在NSCLC患者中發生率約為4~5%,這部分患者經克唑替尼治療後獲得了良好的無進展生存期和客觀有效率,但與其他TKIs一樣,在治療一段時間後也會產生獲得性耐葯,還有一部分患者對TKI藥物表現出原發耐葯。

EML4-ALK靶向藥物的耐葯機制主要包含以下幾個部分:

1、激酶域的突變

激酶域的突變是一種公認的EML4-ALK融合基因靶向藥物的耐葯機制。正常情況下藥物與EML4-ALK受體凹槽中ATP結合口袋區結合,從而競爭性的抑制ATP結合而產生抗癌作用,然而激酶域突變會影響藥物進入ALK活性位點的能力從而產生耐葯。

目前報道的非小細胞肺癌中有關EML4-ALK融合基因耐葯的激酶域有L1196M、C1156Y、F1174L、L1153R、D1203N、S1206Y、I1171T、G1260A、1151Tins、G1202R等。

這些激酶域的突變通過增加空間位阻、活化ALK的構象,使ALK永久磷酸化等途徑來影響藥物與活性位點的結合。這些突變不只是獨立存在於同一腫瘤實體上,可能幾個同時存在,因此EML4-ALK融合基因藥物的耐葯機制具有複雜性。

2、ALK融合基因拷貝數目的擴增

ALK融合基因拷貝數目的擴增,可能是EML4-ALK基因靶向治療藥物耐葯的機制之一。最近研究表明NSCLC患者服用克唑替尼耐葯後,ALK融合基因會有4~5倍的擴增,並伴隨疾病的進展。

3、信號傳導旁路的激活

ALK激酶屬於受體酪氨酸激酶,其下游的相關信號通路包括Ras/MEK/ERK,PI3K/AKT和JAK3-STAT3等。Ras/MEK/ERK信號通路與細胞增殖有關,PI3K/AKT和JAK3-STAT3通路與細胞存活和凋亡有關,克唑替尼通過與其靶點的特異性結合來抑制上述信號通路分子的表達而有道細胞凋亡。

當患者對ALK抑製劑產生耐葯時,信號傳導會繞過原始作用靶點,通過信號旁路激活下游的信號通路,導致ALK抑製劑不能充分抑制腫瘤細胞生長。

目前報道的與EML4-ALK靶向藥物相關的信號傳導旁路有EGFR信號旁路、SHH/GLI1信號傳導通路、K-Ras和KIT/SCF信號傳導通路等。這就提示我們可以通過聯合應用信號通路抑製劑來增加腫瘤細胞對藥物的敏感性。

其他耐葯機制

1、激酶域的突變

自噬具有雙重作用:一方面,能保護正常細胞抑制腫瘤細胞的生長,抑制腫瘤的發生和發展。另一方面,逃避凋亡性細胞死亡的機制能促進腫瘤細胞的生長,與藥物的耐葯有關。

克唑替尼主要通過抑制ALK活性,從而抑制下游信號通路,使腫瘤細胞發生凋亡。但是由於腫瘤細胞的異質性,耐葯後仍存在高表達或高活性的ALK腫瘤細胞,可能通過繼發自噬從而產生耐葯。

2、上皮間充質轉化

細胞表型在上皮和間充質之間的互相轉化稱為上皮細胞間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)和間充質上皮轉化(mesenchymal-epitheli-al-transition,MET)。

EMT和MET現象最早在胚胎髮育過程中被發現,近年來在腫瘤發生和其他疾病中的作用正在逐漸受到研究者的重視。EMT是指上皮細胞去除已分化表型,包括細胞-細胞間粘附、頂-底級性、運動能力低等特性,而獲得了某些間充質細 胞的表型,包括移動、侵襲、抗凋亡等特性。

腫瘤幹細胞學說認為,腫瘤組織或者腫瘤轉移灶中存在極少的且具有無限自我更新能力並可導致。腫瘤發生的細胞—腫瘤幹細胞樣細胞(cancer stem like cells)[3]。這類細胞具有成體幹細胞的某些功能特徵,包括自我增殖和多向分化的能力,稱為「乾性(stemness)」。越來越多的研究表明,EMT與腫瘤細胞的幹細胞特徵密切相關,在腫瘤轉移、治療抵抗和再複發中起關鍵作用。

在NSCLC中,EMT被報道與TKI類藥物的耐葯相關,EMT很可能是克唑替尼耐葯的機制之一。非小細胞肺癌患者易發生腦轉移。

5、克服ALK靶向藥物克唑替尼耐葯的策略

不同靶點的酪氨酸激酶抑製劑聯合治療

克唑替尼的耐葯機制之一是信號旁路的激活,如EGFR,c-MET,K-Ras等通路的激活。所以,克唑替尼耐葯的患者同時應用ALK抑製劑和其他靶點TKI類藥物很可能具有一定的臨床效果。有研究顯示,在獲得性耐葯細胞系中聯合應用克唑替尼和埃羅替尼,以及聯合應用克唑替尼和阿法替尼後,耐葯細胞系的生長受到明顯抑制。

第2代ALK抑製劑

隨著對克唑替尼的耐葯機制的深入研究,促進了2代ALK抑製劑的研發,第2代ALK抑製劑結構上與克唑替尼有很大的不同,能夠有效的抑制ALK繼發性耐葯突變的腫瘤細胞活性。

目前報道的2代ALK抑製劑有已上市的Ceritinib(LDK378)和Alectinib(CH 5424802)以及正處在研究階段的AP26113,ASP3026,X396,X376和TSR-011等。

Ceritinib和Alectinib在文獻中多次報道,其中Ceritinib是由諾華公司研發的選擇性ALK抑製劑,於2014年4月獲得FDA批准,用於治療轉移性ALK陽性NSCLC患者。與克唑替尼相比,該葯有更好的臨床前抗腫瘤活性。活檢組織培養的克唑替尼耐葯細胞中發現Ceritinib能夠克服ALK多種二次突變(L1196M,G1269A,S1206Y和I1171T)引起的耐葯。

Ceritinib和Alectinib藥物簡介

1、艾樂替尼(Alectinib,CH5424802,二代ALK抑製劑)

分子檢測靶標ALK基因重排分析

藥物簡介

Alectinib是一個新型的ALK抑製劑,CH5424802是由中外製葯公司研發的第二代ALK抑製劑之一。

Alectinib的早期試驗顯示其對腦轉移的治療有效,表明該葯能被大腦攝取。血腦屏障阻止分子影像大腦的其中一種方法是將其主動排除血腦屏障,這一過程叫主動外排。主動外排系統不能識別Alectinib,這意味著該葯可以進出腦組織。

2015年12月,FDA批准用於克唑替尼耐葯的ALK+非小細胞肺癌。

2、色瑞替尼(Ceritinib,Zykadia,LDK378,二代ALK抑製劑)

分子檢測靶標ALK基因重排分析

藥物簡介

諾華的LDK378在研期間就獲得了美國食品藥品監督管理局(FDA)授予的突破性治療藥物的稱號,授予是基於該葯正開發用於漸變性淋巴瘤激酶陽性(ALK+)轉移性非小細胞肺癌(NSCLC)的治療。

ALK+NSCLC患者往往是非吸煙者並且比非ALK轉移的NSCLC患者更加年輕,而目前ALK+NSCLC患者的治療選擇十分有限。

有相關實驗證實Ceritinib治療陽性ALK陽性克唑替尼耐葯非小細胞肺癌患者的反應率為56%,中位PFS為7.0個月。體外實驗已證實,Ceritinib對ALK的抑制能力是克唑替尼的20倍。

如果一線克唑替尼進展後,二代抑製劑仍可獲得56%的緩解率。此種藥物的患者使用經驗是有效,但副作用相對效果也比較大。

批准適應症

2015年5月(EU)2014年4月(FDA)克唑替尼耐葯的轉移性ALK+NSCLC。

EML4-ALK已經成為NSCLC治療的新熱點,針對該靶點的新治療藥物在不斷地開發中。然後有許多問題還需要解決,如克唑替尼耐葯後細胞通路的改變,EML4-ALK相關通路與EGFR或K-Ras相關通路之間的關聯以及多靶點共存患者如何選擇靶向抑製劑。

參考文獻:

[1] TAKEUCHI K,CHOI Y L,TOGASHI Y,et al.KIF5B-ALK,a novel fusion oncokinase identified by an immunohistochemistry-based diagnostic system for ALK-positive lung cancer[J].Cell,2007,131(6):1190-1203.

[2] K Rikova. Global Survey of Phosphotyrosine Signaling Identifies Oncogenic Kinases in Lung Cancer.《Cell》, 2007, 131(6):1190-1203.

[3] Alice T, J Clin Oncol. 2013 Mar 10; 31(8): 1105–1111.

[4] H Hatanaka. Identification of the transforming EML4-ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer. 《Nature》, 2007, 448(7153):561-566.

[5] A Yoshida. Bright-field dual-color chromogenic in situ hybridization for diagnosing echinoderm microtubule-associated protein-like 4-anaplastic lymphoma kinase-positi...

[6] L Liu. Detection of EML4-ALK in lung adenocarcinoma using pleural effusion with FISH, IHC, and RT-PCR methods.《Plos One》, 2015, 10(3).

[7] CB De,G Berx. Regulatory networks defining EMT during cancer initiation and progression. 《Nature Reviews Cancer》, 2013, 13(13):97-110.


推薦閱讀:

肺癌晚期能治好嗎?
如何從印度海淘抗癌藥物易瑞沙?
癌友分享:黑暗的穹頂之下,努力帶媽媽看到一絲光亮
癌症和基因的關係如何?
肺癌藥物進口廠家和國產廠家誰靠譜 科普系列61

TAG:癌症 | 肺癌 | 藥物 |