只有8個病例的觀察性研究，卻改變了醫學實踐

小咖有話說：不管是在討論群里，還是私信給小咖的問題中，都有人問過這樣的問題：「我的樣本量為xx，這個數量很小嗎？」。有位夥伴回復說：「病例對照研究中，非常經典的研究，只有8個病例，32個對照，你說少不少？多少，不能一概而論，還要取決你的問題是不是新穎，病例組是否容易獲得等等」。

對這個經典研究感興趣的一位夥伴，花了很長時間搜集資料，完成此文。接下來，讓我們一起回到40多年前，看看這個改變歷史的病例對照研究。

歷史背景

Diethylstilbestrol（DES，Stilbestrol，乙烯雌酚）是一種人工合成的非甾體雌激素物質，1938年在美國問世，最早被用於有流產或早產風險的妊娠期婦女中，作為雌激素補充劑。在40-50年代，乙烯雌酚被廣泛用於全美的高危孕婦，然而在1971年，FDA發布警示公告，指出乙烯雌酚不應用於妊娠期婦女。

FDA的決定是如何做出的？我們要從同年，Dr. Herbst在麻省總醫院進行的一個病例對照研究說起。

病例的發現

Arthur L. Herbst，1959年從哈佛大學醫學院畢業，在位於波士頓的麻省總醫院完成住院醫培訓，成為了一名婦產科醫生。

1966到1969年間，Dr. Herbst在波士頓文森特紀念醫院（Vincent Memorial Hospital，當時承擔了麻省總醫院婦產科的醫療服務，現已正式合併）連續收治了7位女性陰道腺癌患者。

陰道腺癌是一種非常罕見的生殖系統癌症，只佔全部生殖系統癌症的2%，大多出現在50歲以上女性中。然而，這7例患者不僅在短短4年之間連續出現，而且全部是25歲以下的年輕女性，這引起了Dr. Herbst的強烈興趣。他把這7個病例的病理檢驗結果發表在1970年4月的《Cancer》雜誌上。

連續出現的陰道腺癌是怎麼發生的？難道是有了一種新的疾病嗎？醫生首先懷疑病人是否使用了某種共同的陰道刺激物，譬如某種衛生棉條，然而答案是否定的。在性行為方面，在7位病人中，只有1位曾有過性經歷，並未服用過避孕藥。面對著年輕而迷茫的患者，Dr. Herbst決定進行一項病例對照研究，來找出這些不尋常的陰道腺癌的致病因素。

Dr. Herbst-1971年4月

在與病人家屬的交談中，一位母親提到了在懷孕時曾經接受過雌激素（DES）治療，這引起了Dr. Herbst的同事——Dr. Ulfelder的注意（Howard Ulfelder，MD，時任哈佛大學醫學院婦產科麥格教授（Megis Professor））。這7例患者都出生在40年代末，50年代初期，正是雌激素療法在高危產婦中大規模推行的時期，有沒有可能是因為這個當時新推廣的療法造成的副作用呢？會不會是妊娠期的其他因素影響了產兒成年後的健康狀況？

為了回答這個問題，Dr. Herbst和Dr. Ulfelder在這個經典的病例對照研究中納入了8個陰道腺癌病例和她們的母親：7個上文已經提到過，第8個病例（患者22歲）由Dr. Goldstein提供（Donald P. Goldstein， MD，布萊根婦女醫院創始人，也是哈佛醫學院的校友）。

同時，他們選擇了和病例在同時間（誤差不超過5天）、同醫院生產的女嬰以及她們的母親，以1：4的比例選為對照，即每1例病例，匹配4個對照。

研究員利用結構化問卷的方式，調查病例組和對照組的母親在懷孕時（特指病例這一胎，後同）的種種因素，結果如下：

Dr. Herbst指出，孕中雌激素（也就是DES）使用和女童成長期間發生陰道腺癌顯著相關（P<0.00001）。所有接受雌激素治療的母親都從妊娠早期開始治療。有6位母親確定她們接受的是DES治療，剩下的兩位母親中，一位母親的產科醫生確認了當年使用了DES，只有一位母親懷孕期間沒有接觸DES。

在8個病例的母親中，本次生產之前總共發生過10次流產，而32個對照母親中僅僅發生6次。從上表中也可以看出，病例母親發生孕中出血的概率也較大。這兩點，很有可能是當年醫生建議她們進行雌激素療法的原因。

研究結果發表在1971年4月的《新英格蘭醫學雜誌》上。

Dr. Greenwald-1971年8月

Dr. Herbst的病例對照研究剛剛一發表，就引起了婦產科醫生的強烈關注。僅僅3周之後，來自紐約州衛生部門（New York State Department of Health）的Dr. Peter Greenwald就從紐約州癌症登記處找到了另外的5個病例。

有了Dr. Herbst的成功經驗，Dr. Greenwald同樣設計了一個病例對照研究，深入分析了DES療法以及劑量和產兒之後患陰道腺癌的關係。他發現，從1950到1970的20年間從紐約州癌症登記處找到的全部5例疑似病例中，4例病例的母親在懷孕時接受了不同濃度DES治療，劑量從懷孕初期0.1mg-5mg/d到末期100mg-125mg/d不等，剩下的1例接受了雙烯雌酚（與DES類似的另一種人工合成雌激素）治療。

這個研究不僅為Dr. Herbst提出的相關性提供了額外的證據，而且論證了不同濃度DES可能的有害性，引起學界的熱烈討論。這篇研究發表在1971年8月的《新英格蘭醫學雜誌》上。

FDA警告-1971年11月

基於臨床研究中得出的結論，FDA在1971年11月發布警告，根據Dr. Herbst和Dr. Greenwald在《新英格蘭醫學雜誌》發表的研究，以及Dr. Herbst給FDA報告的額外15個病例，FDA認為基本可以確認所發現的陰道腺癌和乙烯雌酚的使用相關。針對這個問題，FDA採取了三個措施：

1. 所有生產DES以及類似物（dienestrol, hexestrol, benzestrol, promethestrol）的藥廠都需要修改藥物說明書，把妊娠期婦女列為藥物禁用對象。

2. 所有其他的雌激素類似物都必須在藥物說明書中寫出「已有統計學研究指出，妊娠期DES使用與產兒多年後發生陰道腺癌顯著相關，其他雌激素是否有此健康危害目前未知，在任何情況下，不建議對妊娠期女性使用雌激素」。

3. 呼籲開展大規模流行病研究，研究DES相關的陰道腺癌發病率，危險人群等等。

響應FDA的號召，美國CDC在1974年啟動了DES Daughters研究，研究所有在胎兒時期暴露在DES治療中的女性，出生後面臨的健康危險。之後，類似的研究也擴展至妊娠期間直接接受DES治療的女性（ DES Mother，1980年啟動），以及男性胎兒（DES Sons，1985年啟動）。

從1938年面世到1971年被FDA叫停，DES及其類似物（使用各種不同的商品名）被廣泛應用在全美各個婦科診所的高危孕婦中，截至CDC 2001年的統計，DES至少影響了5百萬到1千萬美國人。如果不是Dr. Herbst，Ulfelder，Greenwald等人的研究成果，DES的危害可能進一步擴大，影響到更多的人。

四十多年過去了，因為FDA和CDC的及時出面，DES已經不會再應用於妊娠期女性中，大部分受到DES影響的人們已經獲得了妥善的治療。當年進行的病例對照研究，也已經成為了流行病學教材中的經典案列。今天，我們不僅僅是來講這個FDA史上的精彩故事，也來仔細看一看，到底是什麼樣的研究，僅僅靠8個病例，就扭轉了人們對DES治療的看法。

病例對照研究的原理

病例對照研究（case-control study）是觀察性臨床研究中常見的一種，常常用於病因的分析。病例對照的基本原理是，以確定患有某疾病的病人作為病例，以不患病但與病例具有可比性的個體作為對照，通過詢問、實驗室檢查或複查病史、搜集研究對象既往各種可能的危險因素的暴露史，測量並比較病例組與對照組中各因素的比例，經過統計學檢驗，若兩組差別有意義，那麼我們就可以認為這個因素與疾病之間存在統計學上的關聯。

上面的一段話是從課本中抄下來的，讓我們翻譯一下，以Dr. Herbst在1971年做的那個經典的病例對照研究為例。他把收集的全部8例陰道腺癌患者作為病例，按照1:4的比例收集了32個未患病的女性作為對照，通過問卷的方法回顧調查她們的母親妊娠期間的吸煙、出血、DES治療等情況，對兩組進行比較，然後得出DES治療與患陰道腺癌相關的結論。這就是一個經典的病例對照研究的設計。

在滿足了研究設計的基本框架之外，大家都公認Dr. Herbst的這個研究做的好！它好在哪裡呢？我認為主要在這3個方面：

1. 研究的問題很有臨床意義，所以，提出一個好的臨床問題非常關鍵！
2. 收集的病例很特別，也很有代表性（包括了4年內波士頓地區的全部確診病例）；
3. 對照按照研究者提前定義的條件（在同時間（誤差不超過5天）、同醫院生產的女嬰）和病例進行匹配。

前兩點主要與臨床問題有關，那麼第三點中的這個「匹配」為什麼讓我們覺得研究更好了呢？

匹配

經典的病例對照研究設計中，病例和對照可以匹配，也可以不匹配。匹配，最主要的目的是保證病例和對照的可比性。因為對照和病人在某些特徵上是一致的，所以在她們之間做比較的時候，就能夠排除這些因素的影響。譬如，Dr. Herbst以同醫院，同時間生產做匹配，就排除了病例和對照的母親們因為在不同醫院，或者是不同時間就診（我們管這樣的因素叫做混雜因素）產生的誤差，而僅僅觀察她們妊娠期的吸煙情況，DES治療等所造成的區別。

在控制混雜因素的影響之外，匹配還能提高研究的效率。這是什麼意思呢？因為病例和對照按照提前限定的混雜因素匹配了，那麼他們之間的其他任何不同，都可能和我們的分析相關，換句話說，每一個研究對象提供的有用信息量增加了，這提高了統計分析的把握度，並且縮小了所需的樣本量。這也是為什麼，Dr. Herbst的研究，雖然只有8個病例+32個對照，但是結果仍然讓人信服的主要原因之一（當然，提出好的臨床問題是關鍵！）。

在實際應用中，特別是病例數較少的情況下，往往需要通過匹配對照，來控制混雜，獲得可靠的結論。值得注意的是，如果對照是通過匹配得到的，在分析數據的時候需要使用相對應的分析方法，而不能使用普通的t檢驗，卡方檢驗等。Dr. Herbst分析他的配對數據時使用了配對卡方檢驗（Pike與Morrow）和配對t檢驗。其他常用的方法包括McNemar檢驗，條件logistic回歸等等，應該根據研究目的和數據情況選擇。

同時，匹配的研究方法也存在一些局限。包括有些情況下匹配對照不易獲取，匹配過度等等。而且， 一旦研究人員確定使用某個變數進行了匹配，那麼就無法從數據中研究它和疾病發病之間的關係，於是從研究數據本身，我們無法判斷是否存在過度匹配的問題，只能通過臨床知識解釋。所以也不能盲目匹配，避免匹配過度。

總結

今天我們從DES的歷史，FDA如何通過兩個病例對照研究就發布了「孕婦禁用DES」的公告，講到了病例對照研究，以及在其中進行匹配的優缺點。

Take home message：

• 質量高的小樣本的觀察性研究也能提供靠譜的醫學證據
• 我們可以通過病例對照研究探索疾病的病因
• 病例很少，難以獲得的時候可以通過匹配對照的方式控制樣本量
• 當然，最重要的，還是要保持對醫學的靈敏嗅覺，和對科學熱忱的探索之心

參考文獻

1. N Engl J Med. 1971;284(15):878-81.
2. Cancer. 1970;25(4):745-57.
3. CA Cancer J Clin. 1972;22(5):292-5.
4. N Engl J Med. 1971;285(7):390-2.
5. Selected Item from the FDA Drug Bulletin—November 1971: Diethylstilbestrol Contraindicated in Pregnancy, Calif Med. Feb 1972; 116(2): 85–86. v.116(2)
6. CDC. DES update home. https://www.cdc.gov/des/index.html

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