解析度革命的十年
儘管近年來取得了巨大成果，超分辨顯微鏡還是一個相對年輕的領域，而且這個領域中很多縮寫詞的含義不夠深入人心。不過，隨著超分辨顯微鏡打開更寬的成像應用之門，它將帶來科學的神奇時刻。
超分辨光學顯微鏡是過去十年生命科學最重要的發展之一——而且它的進展還在繼續。由於發展如此迅速和重要，以至於一些評論者稱之為「解析度革命」。
多色STED圖像
生物醫學應用的要求非常多——高空間和時間解析度、長採集時間、3D成像、深度組織/in vivo成像等等。使用聚焦光的遠場光學顯微鏡是一種重要的工具，特別是對於活體細胞和有機體的研究。不幸的是，光學顯微鏡是受限的；光的衍射限制圖像的空間解析度。
比如，衍射限制意味著只能以一定程度觀察細胞蛋白質分布的細節。幸運的是，近年來見證了超分辨遠場光學顯微鏡(納米尺度)技術，比如STED、GSDIM、RESOLFT、PALM、STORM、SIM或SSIM，這些技術都以某種方式致力於解決遠場光學顯微鏡在空間解析度受限的問題。
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超分辨顯微鏡是多種超越衍射極限技術的統稱，大多達到納米尺度。舉例如下：
SIM：Structured Illumination Microscopy，結構化照明顯微鏡
STED：Stimulated Emission Depletion Microscopy，受激發射耗盡顯微鏡
PALM/STORM/GSDIM：Photo-Activated Localization Microscopy/STochastic Optical Reconstruction Microscopy/Ground State Depletion microscopy followed by Individual Molecule return，光活化定位顯微鏡/隨機光學重構顯微鏡/基態耗盡顯微鏡
RESOLFT：Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transition，可逆飽和熒光躍遷
SSIM：Saturated Structured Illumination Microscopy，飽和結構化照明顯微鏡
CSREM/CLEM: Correlative SuperResolution optical and Electron Microscopy/Correlative Light and Electron Microscopy，互關聯超分辨光學和電子顯微鏡/互關聯光學和電子顯微鏡
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局部細胞中肌動蛋白纖維骨架的3D-STORM圖像，該投影圖像使用顏色定義深度。
SIM相比傳統的光學顯微鏡在空間解析度上提高了兩倍，但是STED、RESOLFT、PALM/STORM和SSIM進展更大，將光學圖像解析度的極限推向納米尺度。所有這些超分辨技術都拓寬了生物醫學研究的視界。
「從原理上講，任一種超分辨技術都可以應用在任一種樣品，提供『超解析的』圖像，」利茲大學阿斯伯利中心的Michelle Peckham教授說。「實際上，每一種選擇都要考慮到染料、探針、抗體或者適用的熒光蛋白標記，當然還有設備和易用性。」
SIM：雖然複雜，但是一種良好的折中
「SIM應用結構化照明，解析度相比傳統顯微鏡提高了兩倍——不像STED/RESOLFT和PALM/STORM一樣需要開關光子，」牛津大學Wolfson成像中心的首席研究員和科學總監Christian Eggeling教授說。「因此，SIM可以用於傳統樣品，不管是固定或活體細胞，甚至以3D成像。」
對於很多生物成像，提高兩倍是足夠好的，所以SIM是空間解析度和長採集時間之間的良好的折中。但是也有些劣勢。
「STORM/PALM需要繁瑣的數據分析，這是很多人不善長的。只有很少可用的程序代碼，」Eggeling說，「因此數據分析可能失真。人們正在試著改善，開發控制軟體檢查失真，比如說SIM失真檢查。」
Alistair Curd：利茲大學Peckham團隊中的一名3D STORM/PALM研究員
另一個劣勢是，最終生成一張圖像需要記錄多個圖像，這會延長採集時間，也因此降低時間解析度，尤其對於3D記錄。當然，SIM的記錄時間已在逐步得到改善，而且諸如復掃描或艾里掃描顯微鏡等越來越多的相關技術也在出現。總體而言，SIM和相關技術是一種良好的折中，它可能是原子核/染色體成像的最佳技術。
STED：所見即所得
STEM直接得到圖像，不像SIM需要繁瑣的數據分析。STED不僅簡單，而且相當通用，所以適合固定和活體細胞。從原理上講，它利用了共聚焦/寬場顯微鏡用的典型標記染料。
使用iSIM顯微鏡採集的活體細胞中的eGFP-EB1圖像
「STED技術能以納米解析度對亞細胞結構進行光學成像。多光子激發熒光成像提供內部光學切面、有限的光漂白和光毒性、以及更深的穿透，這些對於散射組織都是關鍵優勢，」光譜物理的產品市場高級經理Julien Klein說。
光譜物理提供超快激光器用於混合型STED顯微鏡，將超分辨和多光子激發(MPE)熒光的優勢集成在單一裝置中。
Alexa Cleasby研究員檢查iSIM超分辨顯微鏡中光學元件的對準，該顯微鏡由利茲大學的Peckham團隊搭建。
「在特定的配置方案中，你可以同時利用STED和MPE成像的優勢，這需要一個光譜物理HighQ-2等飛秒紅外1-μm激光器用於雙光子激發，一個可見光連續激光器用於耗盡，」Klein說。
STED的一個獨有特性是空間解析度可以通過激光器的強度調節——2D和3D都行，而且從共聚焦尺度直低至理論的無限尺度。這在圖像採集時有更大的靈活性。
「比如說，如果樣品不是太亮或樣品製備不夠精確，那麼可以犧牲空間解析度提高信噪比，」Eggeling說。「另一方面，空間解析度的調諧還能進行一些獨特的應用，比如STED-FCS(熒光關聯光譜技術)，它能以前所未有的細節展現分子的散射模式。
共聚焦和STED顯微鏡圖像對比
一般認為STED顯微鏡由於高激光光強會導致很強的光毒性，這是指標記物的光漂白和細胞活力。但是，如果在採集模式、標記方式和樣品製備中非常小心，越來越多的活體應用都表明STED顯微鏡是一種適合以高空間和時間解析度觀察細胞動態的好工具。
超快激光器也能用於多種配置方案，比如生成雙光子激發脈衝串或高重頻啁啾耗盡光束。比如，使用玻璃棒和/或光纖將脈寬展寬到幾百皮秒，那麼光譜物理的Mai Tai等近紅外激光器能產生高重頻脈衝耗盡光束。
使用HyVolution 2採集的COS-7細胞圖像
徠卡微系統的Rolf Borlinghaus將STED看做研究包含真正三維尺度的厚樣品的最佳方法。通過超分辨技術HyVolution 2和TCS SP8 STED ONE Nanoscope，徠卡微系統致力於幫助神經生物學、癌症研究和免疫學的科學家觀察活體細胞中的分子相互作用和結構，從而理解生命的真正本性。
PALM/STORM/GSDIM：最流行的技術
這些縮寫雖然不同，但是它們的基本原理都是一樣的。它們的流行是因為相對簡單和高性價比的裝置，因為經常只要普通的全內反射熒光(TIRF)/寬場顯微鏡就足夠。它能在普通實驗中獲得最高空間解析度，而且標記可以使用傳統染料和特殊緩衝來使它們閃爍，也可以使用特殊的光活化或光開關熒光團。
最早的PALM/STORM/GSDIM出現在2006年，它們使用光誘導熒光開關在時間上分離單分子的空間重疊圖像。這允許高精密地確定分子的位置，並根據這些位置重構亞衍射極限解析度的圖像。
「PALM/STORM/GSDIM的解析度因此不受衍射限制，而是受分子位置的測量精度限制，在某些情況下也受到被定位分子的密度限制，」Eggeling說。
缺點包括：1）相當繁瑣的數據分析，用戶必須輸入會引起失真/偏差的閾值；2）最終生成一張超分辨圖像需要記錄幾十萬張相機圖像，這樣導致採集時間太長，因此難以觀察到較快的活體細胞動態；3）需要低背景雜訊，因為需要開關和定位每個隔離的分子，因此TIRF仍是首選採集模式。
當然，這種技術正在穩步改進，特別是在自動化無偏差數據分析、速度和更深樣品成像等方面。新近出現一種稱為Miniflux技術——使用STED的特性改善定位精度，因此大大降低需要的光子數——將開闢新的途徑，Eggeling說。
RESOLFT：柔光照明利於活體細胞成像
RESOLFT應用和STED相同的原理，但是使用的是可逆光開關熒游標記。由於使用這些標記，通過遠小於STED的激光強度就能取得超解析度。柔光照明允許以納米尺度長期記錄細胞和組織中的神經蛋白和它們的動態。
「不幸的是，可逆光開關熒游標記的可用性限制了它的一般應用，「Eggeling說。「但是這些也在不斷改進並變得更實用。」
SSIM：應用有限
SSIM使用可逆光開關，空間解析度相比SIM改進了兩倍。但是問題還是和SIM和RESOLFT一樣——除了原理驗證，實際應用也非常有限。
CSREM或CLEM：電子和光學顯微鏡的結合
CSREM或CLEM是電子顯微鏡和STORM或PALM等超分辨技術的結合。它只能應用於固定樣品，與標記物一起識別某些樣品區域，一般是使用金微珠或蓋玻片上的標記。
利茲大學的Peckham說：「這種技術對於活體細胞的超分辨成像有利——以高解析度檢查特殊蛋白質的行為，然後快速固定(比如使用高壓凝固)，並用電子顯微鏡成像去研究周圍細胞超結構中的蛋白。」
當前和未來的發展
越來越多實驗室在日常中使用STED、RESOLFT、PALM和STORM探測長度遠小於成像光波長的透明物質。其中有些技術正用於產出關於膜結構和神經科學的信息，也用於研究阿茲海默症和亨廷頓症相聯繫的蛋白質凝聚的形成機制。
但是要獲得更好的空間解析度並非易事——精確的樣品製備和優化標記是關鍵。
「一般而言，使用超分辨顯微鏡需要非常小心地製備樣品。不合理的標記或不合理的固定對於共聚焦/寬場顯微鏡可能不要緊，但是會嚴重惡化超分辨圖像，「Eggeling說。」類似的，如果細胞固定不好，那麼超分辨成像要比傳統共聚焦/寬場成像中細胞死亡更快。」
有新技術嘗試在改善空間解析度和裝置/分析的複雜性之間考慮折中。目前有些公司提供艾里掃描或iSIM顯微鏡，兩者和SIM類似，只需在傳統共聚焦或寬場顯微鏡中做一些簡單的添加就能提高達1.7倍空間解析度。另外，有機化學家不斷改善熒游標記的光子產量也是未來改進的基礎。
iSIM一瞥中複雜的光路
FINCH(Fresnel Incoherent Correlation Holography)顯微鏡是Gary Brooke教授(約翰霍普金斯大學顯微中心主任和CellOptic公司CEO)和Nisan Siegel(約翰霍普金斯大學生物醫學工程部研究員)開發的。
FINCH是一種非相干全息的形式，從物鏡出射的非相干光通過一個單光束系統生成全息圖。物鏡發射的光都被分成兩束，差分相位調製每一束光並在公共平面上重新合束生成干涉條紋。自然光子學(doi: 10.1038/nphoton.2016.207)重點介紹了FINCH顯微鏡快速生成超分辨生物圖像的能力。
「FINCH以簡單和易用從其它超分辨技術中脫穎而出，它只要求特殊的成像透鏡和快速計算，不用複雜的照明配置、極大數據集，也沒有限制染色選項，」Brooker說。「FINCH能以各種速度提供和SIM相似的解析度，能對幾乎任意顯微應用進行活體細胞成像。」根據J. Phys. D: Appl. Phys.雜誌文章2015 Super-Resolution Microscopy Roadmap，下一步發展是擴大超分辨顯微鏡的應用，解決更廣的科學範疇。換言之，這意味著顯微鏡必須能用於更寬的樣品範圍。
Roadmap的合作者有領域中一些大名鼎鼎的專家，比如Stefan Hell和Eggeling，文章強調通過自適應光學訪問較厚的樣品將能夠在組織中更多地使用超分辨技術，有望更好地輔助發展生物學、神經科學和其它領域的研究。
使用自適應光學的另一優勢是提高超分辨的可用性，因為它有望達成系統的自校準和自動對準，因此減少現場技術支持的需求。這些進展著手將這些超分辨技術變成普通的實驗室工具。
文章來源：The Decade of the Resolution Revolution
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