微生物菌種的擴大培養及污染的檢測與判別

現代工業的生產規模越來越大，每隻發酵罐的容積有幾十甚至幾百立方米。因此要在短時間內完成發酵，必須要有數量巨大的微生物細胞才行。種子擴大培養的任務就是要獲得數量足夠的健壯的微生物。種子擴大培養是指將保存在砂土管、冷凍乾燥管中處休眠狀態的生產菌種接入試管斜面活化後，再經過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養,最終獲得一定數量和質量的純種過程。這些純種培養物稱為種子。微生物工業自從採用純種發酵以來，產率有了很大的提高，然而防止雜菌污染的要求也更高了。人們在與雜菌污染的鬥爭中，積累總結出很多寶貴的經驗。規範了管理措施，設計了一系列設備(例如密閉式發酵罐，培養基滅菌設備，無菌空氣製備設備等)和管道，應用了無菌室甚至無菌車間，建立了無菌操作技術，因而大大降低了發酵染菌率。但是某些發酵工業還遭受著染菌的威脅，染菌後輕者影響產率、產物提取收得率和產品質量，重者造成「倒罐」，不但浪費大量原材料，造成嚴重的經濟損失，還會對周圍環境造成破壞。凡是在發酵液或發酵容器中侵入了非接種的微生物統稱為雜菌污染，及早發現雜菌並採取相應措施，對減少由雜菌污染造成的損失至關重要。因此檢查的方法要求準確、快速。發酵污染可發生在各個時期。種子培養期染菌的危害最大，因嚴格防止。一旦發現種子染菌，均應滅菌後棄去，並對種子罐及其管道進行徹底滅菌。發酵前期養分豐富，容易染菌，此時養分消耗不多，應將發酵液補足必要養分後迅速滅菌，並重新接種發酵。發酵中期染菌不但嚴重干擾生產菌株的代謝，而且會影響產物的生成，甚至使已形成的產物分解。由於發酵中期養分已被大量消耗，代謝產物的生成又不是很多，挽救處理比較困難，可考慮加入適量的抗生素或殺菌劑。如果是發酵後期染菌，此時產物積累已較多，糖等養分已接近耗盡，若染菌不嚴重，可繼續進行發酵;若污染嚴重，可提錢放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，對發酵的影響就小。所以，實際生產中，應當根據污染程度和發酵時期區別對待。

1 實驗器材與試劑

1.1 器材

高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作台、帶搖床的培養箱、顯微鏡、天平、三角瓶、試管、移液管、培養皿、 接種針、平板塗布器、酒精燈、載玻片

1.2 試劑 營養瓊脂、葡萄糖、磷酸二氫氨、七水合硫酸鎂、氯化鈉、磷酸氫二鉀、牛肉膏、蛋白腖、0.4%酚紅溶液、蒸餾水、番紅染液、香柏油、擦鏡液

1.3培養基

(1)營養瓊脂培養基：直接稱量營養瓊脂粉4.5g，溶於100mL蒸餾水配製，pH7.2，分裝到試管中， 滅菌後擺成斜面。

(2)種子培養基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氫氨 0.1%、七水合硫酸鎂 0.02%、氯化鈉 0.5%、磷酸氫二鉀 0.1%

(3)葡萄糖酚紅肉湯培養基： 牛肉膏 0.3%、蛋白腖 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化鈉 0.5%、 0.4% 酚紅溶液，pH7.2

2實驗方法

2.1種子的擴大培養

2.1.1斜面培養基的配製

配製營養瓊脂培養基，分裝，滅菌(121℃條件下滅菌 30min)，倒斜面。

2.1.2菌種的活化

⑴將大腸桿菌採用無菌操作的方法接種於斜面上，37 ℃下培養18h;

⑵培養 18h 後，觀察菌落顏色是否一致，若均為黃色，挑取培養皿周邊的菌落進行無菌檢測;若顏色有黃有白，則兩種顏色的菌落均要進行無菌檢測。檢測方法常用染色鏡檢，若檢測後，沒有污染，便可進行擴大培養;若檢測到雜菌，要重複上述步驟，直到無菌為止，否則，不能繼續下一步操作。

2.1.3擴大培養

在無菌條件下，從檢測後的活化培養基上挑取10個左右菌落，用接種針接種到擴大培養基(即種子培養基)中，於37℃下振蕩培16-18h，觀察菌落形態。然後配合顯微鏡形態觀察，根據結果來判斷能否進行下一步。

2.2污染的檢測和判別

2.2.1顯微鏡檢查

⑴取樣：用無菌操作方式取發酵液少許,塗布在載玻片上;

⑵製片、染色：自然風乾後,用番紅染液染色 1-2min，水洗;

⑶乾燥後用油鏡下觀察。

2.2.2平板檢查

⑴配製營養瓊脂培養基，滅菌，倒平板;

⑵取少量待檢發酵液經稀釋 (大約 10–6～10–7) 後塗布在營養瓊脂平板上，在 37℃下培養 24h;

⑶觀察菌落形態。

2.2.3肉湯培養檢查法(用於檢測培養基滅菌是否徹底)

將1ml待測液(滅菌處理後的種子培養基)接入葡萄糖酚紅肉湯培養基中，於37℃下培養24h，觀察培養基的狀態和顏色。

3實驗結果

3.1種子的擴大培養

觀察到在活化培養基上長出大量菌落，且菌落顏色單一，均為淡黃色。挑取邊緣菌落及形態一致的菌落少量，製作裝片，染色後在顯微鏡下觀察，發現多個視野中都為桿菌，可初步得出活化的菌種中沒有污染雜菌。挑取沒有污染雜菌的菌落，用無菌操作技術接種，進行擴大培養。在適宜條件下培養 18h 後，得到了大腸桿菌的種子液，吸取該種子液在顯微鏡下觀察到有大量的大腸桿菌。

3.2 顯微鏡檢查

鏡檢時，多個視野中均觀察到的均為桿菌，呈鏈狀或單個存在，沒有觀察到球菌或其它形態的的細菌，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染。

3.3 平板檢查

從營養瓊脂平板培養基上觀察到菌落的形態為圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明或乳白色、菌落上有小的突起，這是典型的大腸桿菌菌落，沒有觀察到其它形態的菌落，因此可初步認為該種子液中沒有雜菌污染。

3.4 肉湯檢測培養基滅菌是否徹底

葡萄糖酚紅肉湯培養基中有酚紅染液，酚紅在酸性環境中呈黃色，鹼性環境中呈紅色。肉湯培養基中接種的待測液若有菌體存在，則菌體代謝會使培養基呈酸性，顯示黃色。該肉湯培養基經培養後，仍呈現紅色，沒有變為黃色，且澄清，未渾濁，說明待測液中沒有菌體存在，，因此，所測的滅菌種子培養基中沒有被菌體污染。

4實驗討論

4.1 在種子的擴大培養前要對菌種進行活化培養以獲得有活性的種子，若菌種已活化則可省略這一步。種子擴大培養時，如果低溫保藏的菌種污染了雜菌，則應棄去或用平板培養基純化後再用來活化和擴大培養。

4.2 採用顯微鏡檢查法，如果從視野中發現有與目標菌株不同形態的菌體則可認為是污染了雜菌，該法簡便、快速，能及時檢查出雜菌。但是也有其不足之處：①對含雜菌少的樣品不易得出正確的結論，故應多檢查幾個視野;②由於菌體較小，本身又處於非同步狀態，應注意不同生理狀態下目標菌與雜菌的區別，必要時可用革蘭染色、芽孢染色等輔助方法鑒別;③對固形物多的發酵液檢查較困難。

4.3 採用平板檢查法，若出現與目標菌株形態不一的菌落，就表明可能被雜菌污染;若要進一步確證，可配合顯微鏡形態觀察，若個體形態與菌落形態都與目標菌相異，則可確認污染了雜菌。此法適於固形物較多的發酵液檢測，形象直觀，肉眼可辨，不需儀器。但需嚴格執行無菌操作技術，所需時間較長，而且無法區分形態與目標菌相似的雜菌。在污染初期，目標菌占絕大部分，污染菌數量很少，所以要做比較多的平行試驗才能檢出污染菌。

4.4 肉湯培養檢查法只能用來檢測培養基的滅菌是否徹底，不適用於發酵液的檢查。

4.5 可以用發酵參數判斷法來檢測是否有雜菌污染。即在發酵過程中，以發酵時間為橫坐標，以溶解氧或排氣中二氧化碳含量或發酵液的pH為縱坐標，作曲線，若在工藝不變的情況下這些特徵性曲線發生變化，則很可能是污染了雜菌。但是，發酵參數判斷法很難檢查出早期的污染菌。

5 實驗結論

本實驗我們了解了種子製備的方法和發酵污染的危害，知道染菌不僅浪費大量原材料，造成嚴重的經濟損失，而且污染了環境，所以，在種子活化培養和擴大培養中每一步均需進行無雜菌檢查。顯微鏡直接檢查法和平板間接檢查法都可以用來檢測雜菌污染，方法較為簡便、形象直觀，但是，若要進行更準確的檢測，最好再做較多的平行實驗。肉湯培養檢查法是用於檢測培養基滅菌是否徹底的有效方法。

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