羅敏敏實驗室建立新型免疫信號放大方法 | 中國發現

? isHCR原理示意圖。

撰文 | 林 睿

責編 | 葉水送

知識分子為更好的智趣生活 ID：The-Intellectual

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當需要測定樣品中特定分子的含量時，通常會用到免疫化學分析方法，這是一種基於抗體和抗原間特異性結合的生物化學分析方法，在基礎科研、醫療診斷、檢驗檢疫和司法鑒定等領域中，屬於最為常用的檢測技術。

免疫化學分析的原理是利用帶有信號分子的抗體特異性識別樣品中的目標生物分子，通過測量信號強度對目標分子進行定量。在實際應用中，樣品中目標分子的含量一般較低，為了提高檢測靈敏度，免疫化學分析中通常會引入化學反應以增加信號強度。

傳統信號放大方法主要基於酶促反應，將酶與抗體相偶聯，利用酶的催化活性將無信號的底物不斷轉變為有信號的底物從而實現信號放大。由於酶促反應有非常強的信號放大能力，這種傳統信號放大方法被廣泛應用在免疫化學分析中。但是，隨著近幾年顯微成像技術和樣品製備技術的迅速發展，傳統信號放大方法的缺點逐漸顯露出來——主要包括降低成像解析度、難於同時檢測多個目標分子、不適用於大體積組織樣品等。

2月26日，北京生命科學研究所羅敏敏實驗室在Nature Methods雜誌上發文，建立了一種基於雜交鏈式反應（hybridization chain reaction, HCR）的新型免疫信號放大方法——isHCR。

與傳統信號放大方法所採用的酶促反應不同，isHCR所採用的雜交鏈式反應不需要蛋白的參與，完全由DNA分子進行反應，從而規避了傳統信號放大方法的弊端。

在雜交鏈式反應中，單鏈DNA分子（HCR initiator）觸發一對帶有熒光分子標記的單鏈DNA分子（HCR amplifier）的自組裝，形成帶有許多熒光分子的雙鏈DNA長鏈。為了在免疫化學分析中引入雜交鏈式反應，研究人員將HCR initiator偶聯到抗體蛋白上，並利用該抗體特異性地結合樣品中的目標分子，形成目標分子—抗體-HCR initiator複合體。之後，再向體系中加入熒游標記的HCR amplifier。目標分子通過HCR initiator觸發HCR amplifier的自組裝，從而被反應形成的熒光DNA長鏈所標記。

研究人員在不同類型的生物樣品和實驗中驗證了isHCR，證明相比於傳統免疫組化方法，isHCR均顯著提高了熒光信號。

研究人員對isHCR進行了優化：利用氧化石墨烯（graphene oxide, GO）結合併淬滅遊離的HCR amplifier，降低了isHCR的背景噪音並提高信噪比。同時，在isHCR的基礎上開發了多輪信號放大方法isHCRn，進一步提高了信號強度，成功地利用isHCR檢測了多種蛋白在小鼠腦組織中的分布，以及細菌分泌的干擾素在宿主細胞內的分布。

運用DNA分子進行信號放大反應的一大優勢是，能夠利用DNA序列的多樣性對多種目標分子同時進行信號放大。研究人員將兩種序列不同的HCR initiator分別偶聯到兩種不同的抗體上，並利用兩對序列不同且互不干擾的HCR amplifier，成功實現對兩種目標分子的同時檢測和信號放大。進一步，研究人員將isHCR和基因編碼的蛋白標籤相結合，實現了不依賴於抗體的多目標蛋白同時檢測。

近些年來，組織樣品製備技術發展迅速，特別是用於膨脹組織樣品的Expansion microscopy（ExM）和針對大體積組織樣品的透明化技術。利用對HCR initiator的化學修飾，研究人員將isHCR引入ExM樣品製備過程中並實現了信號放大，通過一步簡單的甲醛固定，使得isHCR放大所得信號在組織透明過程中得以保留。研究人員成功利用isHCR對成年小鼠肺部進行全組織染色，以及在厚腦組織切片中實現了不依賴於抗體的細胞特異性標記。

? isHCR可實現不依賴抗體的多種蛋白同時檢測，並適用於ExM和uDISCO樣品製備技術

相比於傳統信號放大方法，isHCR具有放大倍數高、模塊化設計和可同時放大多個目標等優勢，在病理診斷和檢驗檢疫等領域有著廣泛的應用前景。考慮到DNA分子可進行多種化學修飾，未來有更多潛在的化學反應可被整合入isHCR方法中。同時，isHCR還可與多種新型成像技術相結合，以實現對生物分子的高通量原位檢測。

羅敏敏實驗室博士生林睿為本文第一作者，其他作者包括羅敏敏實驗室馮琦茹、王睿宇，邵峰實驗室李鵬博士、周平博士、邵峰博士，湯楠實驗室劉哲博士、湯楠博士，以及化學中心王志強、齊湘兵博士。

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Lin R et al. A hybridization-chain-reaction-based method for amplifying immunosignals. Nature Methods. 2018. doi:10.1038/nmeth.4611.

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