動物細胞培養指南（三）

導讀

前面兩期為大家介紹了細胞如何成功的復甦培養和傳代培養，本期為大家重點介紹細胞培養基。

細胞培養基既是培養細胞中供給細胞營養和促使細胞增殖的基礎物質，也是培養細胞生長和繁殖的生存環境。製備完全培養基都需要哪些物質？有什麼注意事項？本文為您詳細敘述。

基礎培養基

細胞培養基成分複雜，包括鹽類、糖類、維生素、氨基酸、代謝前體、生長因子、激素和微量元素。對這些物質的需求因細胞而有差異，這也導致大量的不同培養基配方出現。主要碳源物質通常是葡萄糖，有時也會使用半乳糖代替，這是因為半乳糖的代謝速度較慢。氨基酸（尤其是L-谷氨醯胺）和丙酮酸鹽也可作為碳源。

除了營養成分，培養基也會幫助維持培養體系的pH和滲透壓。pH的維持依靠一種或多種緩衝液體系，最常見的包括CO2/NaHCO3、磷酸鹽和HEPES等，血清也可以作為完全培養基的緩衝液。酚紅作為pH指示劑加入培養基中，可通過顏色變化監測pH變化。

1.碳酸氫鈉和緩衝液

細胞的存活和生長，需要CO2同時也會產生少量CO2。在培養基中加入CO2可以與HCO3-形成平衡，所以很多種類的培養基會通過CO2/HCO3-體系平衡pH。CO2直接溶解在培養基中並形成H2CO3。隨著細胞代謝併產生更多的CO2，培養基pH下降並導致下面的化學平衡向右移動：

H2O + CO2←→ H2CO3 ←→H+ + HCO3-

理想的pH範圍是7.2—7.4，可以通過補充NaHCO3和調節上層空氣中的CO2水平來維持，化學過程如下：

H2O+CO2+NaHCO3←→H+ + Na+ + 2HCO3-

組織培養時，細胞可能在開放體系中（培養基上層空氣和培養箱中空氣可以自由交換）生長，也可能在封閉體系中（培養基上層空氣和培養箱中空氣相互隔離）生長。培養基中的緩衝體系需要與這些培養方式匹配，否則細胞狀態會由於代謝壓力而變差。

封閉體系中的CO2水平是由細胞代謝調節的。培養容器必須密封（如擰緊細胞瓶蓋）以保存細胞產生的CO2。因此，與開放體系相比，封閉體系可以對細胞提供更多的保護以避免污染，對培養箱的要求也更低。封閉體系使用的緩衝體系通常基於Hanks液，該體系的NaHCO3水平較低。

在開放體系中培養細胞時，可通過控制空氣濕度（可以減少培養基蒸發）和CO2的調節方式（如果培養基含NaHCO3）來維持pH。在開放體系中，需要含更高NaHCO3濃度的Earles平衡鹽溶液，並且由培養箱維持5-10%CO2。通常，1.2-2.2g/L NaHCO3配合5% CO2，3.7 g/L NaHCO3配合10% CO2。精確的計量因培養基配方而不同。

有些情況下，研究人員會向培養容器中連續充入過濾除菌並含5% CO2的空氣，然後嚴格密封並放置在乾燥且無CO2的培養箱中。實際上，這時培養基也是處於開放系統中。

2.HEPES

HEPES和其他有機緩衝液可以有效調節培養基pH，適用於多種細胞系。實際上，某些標準培養基配方包含HEPES。但是，HEPES可能會有毒性，尤其是對某些已分化細胞，所以使用前需首先評估其效果。

3.酚紅

酚紅可作為培養基的pH指示劑。酚紅在低pH時顯示黃色，在高pH時則顯示紫色。絕大多數組織培養時，pH為7.4，應顯示為鮮紅色。

4.L-谷氨酸鈉

L-谷氨醯胺是所有哺乳動物細胞和昆蟲細胞的必需氨基酸。與其它氨基酸相比，L-谷氨醯胺在液體培養基中更不穩定。因此，為了延長保質期，商品化的液體培養基中經常不添加L-谷氨醯胺。這種情況下，使用前要先無菌加入L-谷氨醯胺。由於在乾燥狀態下比較穩定，所以絕大多數乾粉培養基中都已預添加L-谷氨醯胺。

5.非必須氨基酸

所有培養基配方包含十種必需氨基酸，同時包括半胱氨酸、谷氨醯胺和酪氨酸。在一些培養基配方中包含其他非必需氨基酸(丙氨酸，天冬醯胺，天冬氨酸，甘氨酸，谷氨酸，脯氨酸，絲氨酸)，降低了細胞的代謝負擔，有利於細胞增殖。

培養基添加物

細胞培養使用的完全培養基，需要添加一些在基礎培養基和血清中沒有的成分，包括激素，生長因子及信號分子，目的是維持細胞增殖和正常的細胞代謝功能。

添加物可以改變完全培養基的滲透壓，這可能影響細胞的生長。加入添加物後，最好重新檢查一下完全培養基的滲透壓。對於脊椎動物細胞系適宜的滲透壓在260 mOSM/kg 到 320 mOSM/kg。

添加劑加入基礎培養基後，完全培養基的質保期需要根據具體情況決定。如果完全培養基包含蛋白類添加劑（如：表皮生長因子、牛血清白蛋白等），降解速度會比基礎培養基更快。

滲透壓

雖然大多數細胞系可以承受的滲透壓壓力範圍比較寬泛，但脊椎動物細胞承受的壓力範圍較窄，在260 mOsm/kg 至 320 mOsm/kg。相比之下，無脊椎動物細胞承受的滲透壓不在這個範圍內。例如, 蝸牛胚胎細胞，需要滲透壓大約155 mOsm/kg，然而有些昆蟲細胞在360mOsm/kg至375 mOsm/kg更適宜生長。大多數商業培養基會標註滲透壓，在鹽溶液，藥物或者激素溶解在酸性或鹼性溶液，或者加入較大體積緩衝溶液（如：HEPES）後，需要檢測培養基滲透壓。

抗生素

抗生素或抗真菌劑加入到細胞培養基中一般用於以下目的：

1）預防污染；

2）一旦發現污染作為一種挽救手段；

3）誘導表達重組蛋白；

4）保持轉染細胞的選擇性壓力。

在常規細胞培養中，除非特別需要，一般不推薦使用抗生素或抗真菌劑。因為抗生素對許多細胞有毒性，並且掩蓋支原體、細菌污染。此外，它們可以干擾敏感細胞的代謝。

如果使用抗生素，青黴素鏈黴素溶液可以每100ml的細胞培養液加入0.5-1 ml，使青黴素終濃度為50-100 IU/ml，鏈黴素終濃度為50-100μg/ml。另一種抗生素慶大黴素，使用終濃度為50-100μg/ml。抗真菌兩性黴素B使用終濃度2.5 μg/ml。以上濃度適用於含血清培養基。對於無血清培養基，至少減少50%的濃度。

動物血清

血清在細胞培養中為細胞提供氨基酸，蛋白質，維生素（特別是脂溶性維生素如A，D，E，K），碳水化合物，脂肪，激素，生長因子，礦物質及微量元素。此外，血清還可以緩衝培養基，抑制蛋白水解酶，增加培養基的粘度，降低在移液或攪拌時造成的剪切力。

1.儲存

血清的保質期是5年，儲存溫度小於-10℃。

血清長時間儲存在2-8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等)可能聚集而形成沉澱或可見的混濁。因此，長期保存血清必須在-10℃以下儲存，並避免反覆凍融。

2.解凍

將血清從冷凍箱取出後，先置於2～8℃冰箱使之融解，然後在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。

如果在37℃或更高的溫度解凍血清，血清中會出現沉澱。此沉澱可能包括磷酸鈣結晶，但不改變血清的性能。血清熱滅活也會導致沉澱的形成。

3.渾濁和沉澱

所有的血清可能保留一些纖維蛋白原。某些外部因素可能引發纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，導致血清解凍後可能會觀察到絮狀物或混濁。這些物質的存在不會改變血清的性能。如果有必要，可以通過400g離心1min離心去除。

4.熱滅活

通常不使用熱滅活血清，除非某些特定的細胞系特別需要。熱滅活通常是不必要的。熱滅活會降低或破壞血清中的生長因子，影響某些細胞的生長。

熱滅活最初是為了滅活補體及支原體。目前，如果血清中出現支原體，可以通過過濾去除。而去除補體通常是不必要的，除非是在準備或檢測病毒或細胞毒性試驗時。有研究顯示，血清37℃孵育就可以滅活血清中熱不穩定的補體成分。只有很少一部分細胞在這種滅活血清中生長得更好。如胚胎幹細胞和許多昆蟲細胞。

下面的程序可用於熱滅活血清：

1）按正確操作解凍血清，恢復室溫。

2）水浴56℃提前預熱。

3）將準備好的血清和裝有相同體積水的燒杯同時放入水浴鍋，當燒杯中的溫度計指示達到56℃時開始計時，滅活30min後結束，整個過程中需要隨時搖晃混勻。

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