浙大於洪巍實驗室Biotechnol Bioeng文章：採用溫度切換調控釀酒酵母中的生物合成途徑

近年來，採用合成生物學的方式改造微生物進行大宗化合品或者高附加值化合物的合成已經成為國內外多個課題組研究的熱點。傳統的微生物細胞代謝途徑改造，通常採用的是代謝途徑中酶的進行過表達，但該種策略往往使用組成型強啟動子而造成宿主細胞代謝壓力，從而影響細胞生長以及目標產物的合成。

一般而言，若能夠在宿主細胞中實現生物合成途徑基因的可控表達，在合適的時間，以適當的強度開啟目標合成途徑，使細胞生長與產物積累分階段進行，則能夠在很大程度上避免生物量積累和產物積累之間的衝突。

2018年1月24日，浙江大學化學工程與生物工程學院於洪巍教授課題組在生物化工國際權威期刊Biotechnology and Bioengineering上在線發表了題為：Development of a temperature-responsive yeast cell factory using engineered GAL4 as aprotein switch的文章。在該文中，作者採用溫度作為動態代謝調控的輸入信號，實現了在發酵過程中通過溫度切換控制釀酒酵母中外源代謝途徑的開啟和關閉。

首先，作者利用釀酒酵母中經典的GAL調控系統中的GAL80-GAL4-GAL promoter三者之間的作用和反作用關係，敲除了調控系統中的GAL80抑制蛋白，使得GAL啟動子的活性直接與GAL4相關。據此原理，若外源合成途徑基因均採用GAL promoter控制表達，則該途徑的表達強弱與轉錄因子GAL4的活性呈相關性。

接著，作者很巧妙地設計了一個高通量篩選方法。在敲除了GAL80基因和GAL4基因的釀酒酵母細胞內整合了GAL1和GAL10 promoter控制的番茄紅素合成途徑，用於作為高通量篩選的宿主。藉助釀酒酵母高效的胞內同源重組機制，結合定向進化技術對組成性啟動子控制下的GAL4轉錄因子進行了溫度敏感型突變體的篩選（下圖a和b）。由於作者需要的是溫度敏感型的GAL4突變體，因此，在只需要在酵母的正常生長溫度（30℃）生長環境下為白色的菌落即為GAL4無活性的克隆，將此類克隆挑選，再點菌到平板上低溫環境下生長（文章中採用的為21℃），若原來在30℃生長的白色菌落在21℃條件下變紅色，說明此克隆中的GAL4突變體在30℃和21℃呈現出非活性→活性狀態的轉變。由此反覆再驗證，則可得到溫度敏感型的GAL4轉錄因子。由於菌落是否產番茄紅素能很容易用肉眼進行分辨，採用這種方法也就大大簡化了突變體庫的篩選。

為了進一步驗證所篩選溫度敏感型GAL4蛋白，作者將所篩選的突變體整合進了酵母染色體中替代了之前的野生型GAL4基因，並進行了GAL啟動子控制下基因表達的real-timePCR驗證和GAL啟動子控制下的EGFP基因表達強度驗證，均證實了通過切換培養溫度，可以有效控制GAL啟動子驅動下的基因表達水平。由此構建的新菌株，GAL啟動子的轉錄由通常敲GAL80基因的葡萄糖控制模式（下圖a）變成了溫度信號控制模式（下圖b）。

此外，作者利用該溫度調控系統構建了一株受溫度調控的高產番茄紅素的菌株Ylyc-TS03（+），並對其進行了高密度發酵實驗，實現了細胞生長階段和產物合成階段的分階段精細調控，使最終OD達到了280，產量達到了1.14g/L，菌株在產量方面較攜帶野生型GAL4基因的菌株提高了177%，這在應用上也證實了溫度調控模式有利於次級代謝產物的合成。

該文的研究中作者篩選到了低溫具有活性的GAL4突變體，若能再設計實驗，篩選到只有在高溫條件下才具有活性的GAL4突變體，或許將具有更好的應用意義。

合成生物學通過設計生命、合成再造、重塑生命，開創全新科學研究模式，在健康、藥物、化學品生物製造、生物燃料合成、環境等領域形成顛覆性技術。在最近發布的合成生物學重點專項2018年度項目申報指南就提出了：將圍繞基因組人工合成與高版本底盤細胞、人工元器件與基因線路、人工細胞合成代謝與複雜生物系統、使能技術體系與生物安全評估等 4 個任務部署項目。

其中的人工元器件與基因線路一直以來都是合成生物學研究中較為重要的一方面。各國的研究者在開發與天然化合物合成或底盤細胞調控/正交線路構建等功能相關的生物元器件功能預測、設計、標準化表徵、改造與構建的技術已做了不少研究。

總體而言，為了控制目標工程菌株中目標途徑/基因的表達，所採用的基因表達調控措施無外乎為：1）化學信號控制；2）物理信號控制。以往的研究中這兩種控制主要體現在對啟動子的改造上。

化學信號控制方面：例如基於營養物質的控制（糖類及其類似物，磷元素，胞外氨基酸濃度，胞外金屬離子濃度等）和基於細胞密度調控的基因迴路（lux群體感應系統、Esa群體感應系統和信息素群體感應系統）已經在細菌和酵母中得到了較為廣泛的應用。上述信號控制往往是單向的，信號輸入到體系中後不便於解除。

物理信號控制方面：例如採用藍光誘導的T7RNA聚合酶在大腸桿菌中實現了應用（可參考原文：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.7b00169）。物理信號控制的優點在信號的輸入和終止操作可控性強。由於光照培養在大規模發酵過程中並不易實現，或者需要對現有的發酵設備進行升級改造，因此其在大規模發酵中的實際應用也存在一定問題。相比較而言，諸如該文中採用溫度調控轉錄因子的模式更適合放大生產使用。參照該原理，T7 RNA聚合酶是否也可以開發出具有溫度敏感型的突變體呢？

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於洪巍課題組介紹

浙江大學化學工程與生物工程學院生物工程研究所教授，博導。研究領域：酶定向進化及理性設計，酶催化手性藥物拆分及合成的研究，代謝工程與合成生物學等。

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