提問使人快樂！Western Blot 結果條帶全面分析

"提問使人快樂"

一篇科學網的熱門博客這樣說：

因提出問題，

即豐收在望！

做了多年Western Blot，

各種奇形怪狀的結果條帶，

是否已經集齊，

可以召喚出一部3天3夜的故事了？

比如：一個做 western blot 的小女孩、、

小編已集齊14隻「神獸」，

成功召喚出「神龍」

對Western Blot 結果條帶進行全面分析：

Q1. 啥也沒有

[原因]：比較多，如果單純一張沒有任何顯色的X光片，最可能是一抗加成其他抗體，或者二抗種屬加錯了，比如兔的加成鼠的。

[解決辦法]：仔細檢查抗體是否加錯，確認轉膜沒有問題。

[經驗]：上面的圖片展示的是一點信號都沒有，如果是這樣大部分情況是抗體加錯了。如果中間出現了細微的條帶，可能原因是蛋白上樣量太少，一抗濃度過低，ECL發光液失效。另外如果轉膜出現了問題，比如膜放反了，自然是一個白片。

Q2. 高背景

[原因]：封閉不夠好，一抗濃度高，洗膜時間和次數不夠

[解決辦法]：降低一抗濃度，增加洗膜時間和次數。

[經驗]：高背景可能是WB中最常見出現的問題，目的條帶單一清晰，但是其他地方又瀰漫性較為均一的背景（比較連續的）。其實只要我們注意操作規範，不偷工減料就很容易避免，洗膜按照規定來5min*5次或者10min*3次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。

Q3. 非特異性條帶

[原因]：一抗非特異性與蛋白結合

[解決辦法]：更換一抗

[經驗]：此種情況絕大多數是因為一抗不好，你無法判斷那一條是目的條帶。如果實在沒有更好的抗體，建議採用陰性對照和陽性對照來確定上述哪個條帶是目的條帶。當然這種情況下有一種很小几率的可能是一抗濃度太高引起的非特異性結合。

Q4. 條帶中出現邊緣規則的白圈

[原因]：電轉中膜和膠之間存在氣泡。

[解決辦法]：轉膜前去掉膜和膠之間的氣泡

[經驗]：我們常常將電轉液倒入一個盤子里，倒入的液體不能太多也不能太少，最好的高度是與放上第一層濾紙齊平，然後往濾紙上澆點轉膜液，把電泳膠用清水清洗下，將電泳膠平鋪到濾紙上，仔細檢查濾紙與膠之間是否有氣泡，可以左右前後觀察，不同方向觀察之後確認無氣泡，然後再往膠上面澆點電轉液，用兩隻手的拇指和食指輕輕夾住PVDF膜的兩側中間，使膜成U型，然後將U型的底部接觸膠的中間，慢慢往兩邊放下膜，這樣一般氣泡很少。然後上層濾紙同樣用U型的放置方法，用玻璃棒稍微貼實下，然後蓋上海綿。注意不要來回趕氣泡，這樣反而會帶入氣泡。

Q5. 條帶中間出現白色（反白）

[原因]：中心部位高濃度HRP把底物消耗過快，中間部位底物消耗結束之後就不發光了

[解決辦法]：降低蛋白量，降低一抗和二抗的濃度。

[經驗]：如果你足夠迅速，可以在中間部位底物消耗之前就把X光片給定影出來，但是時間很難把握，建議還是從降低蛋白量，降低一抗二抗濃度入手。

Q6. 出現黑點和黑斑

[原因]：膜上其他部位與一抗或者二抗非特異性結合

[解決辦法]：封閉牛奶一定要純，封閉結束之後要洗

[經驗]：我們常常是等到要封閉的時候發現沒有牛奶，然後匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的時候往往不管是否已經完全溶解，如果沒有完全溶解的情況下加牛奶倒膜上，會導致很多不溶性顆粒附著在膜上，這就會導致發光時候膜上的黑點。所以牛奶溶解之後，最好靜止一下，然後輕輕地吸取上層牛奶進行封閉，封閉結束之後一定要洗三遍之後再加一抗。

Q7. 條帶拖尾

[原因]：蛋白量太大，一抗濃度和時間太長

[解決辦法]：根據情況調整蛋白量，同時一抗濃度和時間也可以縮短。

[經驗]：這種情況很容易出現，因為很多原因都可能導致這一個結果。一般來說，蛋白量都是我們經過很多次摸索得出的最適蛋白量，因此不太可能是蛋白量過多引起的。最有可能的是因為一抗濃度太高，作用時間太長引起的。另外洗一抗和洗二抗千萬不要偷工減漏，建議5min*5次，不要但是洗這麼多次就把抗體和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗體的結合是通過這種方式洗不掉的。

Q8. 出現重影

[原因]：熒光強度比較高，在壓片時，放好之後不小心又輕微移動了一段距離

[解決辦法]：X光片放上去之後，就不要動了，即使放歪了也沒關係。

[經驗]：有的時候出現重新剛好在上下位置，並且重影會相對弱一些，不要誤以為抗體識別了該蛋白的另外一種異構形式。

Q9. 出現非均一性背景

[原因]：膜可能曾經干過

[解決辦法]：在每一步的操作過程中，都需要注意不要讓膜干

[經驗]：在封閉的時候，洗一抗，洗二抗，以及發光的時候都時刻需要注意蛋白面不要風乾，風乾之後結果很可能就是這個樣子。注意與高背景區別。

Q10. 某個條帶變形

[原因]：SDSPAGE膠中存在氣泡或者某不溶性顆粒

[解決辦法]：配膠過程中要小心，使用無雜質的液體。

[經驗]：很多實驗室中使用的不是最新的設備，比如配膠用的海綿墊，如果用了很多年之後，會從下面往上面漏小氣泡，當氣泡足夠小並且膠快凝固的時候，走到中間的小氣泡就停留在膠內，並會影響到後面的跑膠。另外配膠用的水，SDS，Tris緩衝液要注意不要有雜質。

Q11. 條帶呈啞鈴狀

[原因]：配置膠有問題

[解決辦法]：把膠配好，不合格的膠堅決不用

[經驗]：出現啞鈴最大的可能是膠沒有配置好，膠凝固後不均一，不知道大家有沒有出現如下的配膠情況，下圖中示意拔完梳子之後的結果，如果你拔完梳子之後出現圖中下面部分的樣子，多半會出現啞鈴狀。另外還有一種可能是樣品中含有太多雜質，沒有離心下來，然後雜質沉積在孔的中間，蛋白自然被推擠到兩邊。

Q12. 最邊緣條帶彎曲

[原因]：電泳電流不均一

[解決辦法]：換用新的電泳槽； 不使用兩邊的兩孔

[經驗]：一般我們使用的是10孔的的膠，如果你上樣剛好10個孔，那麼最兩頭的兩個孔肯定會歪曲。另外上樣最好在膠的中間，這樣電場均一。

Q13. 電泳過程中出現現象及問題

（1）整個條帶呈 「 ︶ 」 狀：凝膠冷卻不均一，電泳槽老化。

（2）整個條帶呈「 ︵ 」： 凝膠左右兩頭沒有凝固好

（3）溴酚藍拖尾：樣品溶解不好。

（4）縱向的紋理：上樣樣品中存在不溶性顆粒

（5）溴酚藍很粗：濃縮膠濃縮效果不好，可能是濃縮膠太短，或者是濃縮膠配錯。

（6）在分離膠中跑不動：Tris-Cl PH值不對，或者忘記加SDS。

Q14. 其他問題

（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是膠的濃度與目的蛋白的濃度不對應，比如說100KD的蛋白你用12%的膠跑，或者說20KD的蛋白你用6%的膠跑。

（2）蛋白質降解。蛋白質降解後很可能會在比原來位置低的地方出現主帶，然後會出現一些其他帶，最主要特點是所有的條帶比正常的都低，並且條帶模糊不清晰。

（3）所有條帶連成一片沒有間隔。原因最可能是上樣量過多，其次是樣品彌散（比如電泳長時間停止樣品彌散）。