石蠟切片VS冰凍切片！論勤奮，竟不如一隻佛系蛙？

作為一個學霸蛙，

不出門的時候，

在家裡也會沉浸在學習思考之中：

看文獻、寫論文、、

各位「麻麻們」

喂完三葉草

記得回來充電~

在組織實驗中，

石蠟切片和冰凍切片是最常見的兩種切片方法

石蠟切片VS冰凍切片

石蠟切片不僅用於觀察正常細胞組織的形態結構，也是病理學和法醫學等學科用以研究、觀察及判斷細胞組織的形態變化的主要方法，而且也已相當廣泛地用於其他許多學科領域的研究中。

冰凍切片是一種在低溫條件下使組織快速冷凍到一定的硬度，然後進行切片的一種方法。製作過程較石蠟切片快捷、簡便，因而多應用於手術中的快速病理診斷。

實驗步驟

一、石蠟切片

1. 固定：

將新鮮組織切成小塊，固定於4%多聚甲醛過夜。凝固組織中的物質成分，儘可能保持其活體時的結構。同時能使組織硬化，有利於切片的進行。

2.脫水：

為了減少組織材料的急劇收縮，應使用從低濃度到高濃度遞增的順序進行經70%、85%、95%直至純酒精（無水乙醇），每次時間為1小時。固定後的組織材料需除去留在組織內的固定液及其結晶沉澱，否則會影響後期的染色效果。

3.透明：

常用的透明劑有二甲苯，二甲苯是石蠟的溶劑。純酒精不能與石蠟相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的溶劑，替換出組織內的酒精。材料塊在透明劑浸漬過程稱透明。

4.浸蠟：

先把組織材料塊放在熔化的石蠟和二甲苯的等量混合液浸漬1小時。先後移入2個熔化的石蠟液中浸漬1小時左右。

5.包埋：

以少許熱蠟液將其底部迅速貼附於包埋盒內上，然後置於速凍台，讓石蠟固定。

6.切片：

切片刀的銳利與否、蠟塊硬度是否適當都直接影響切片質量，可將蠟塊至於冷水中改變蠟塊硬度。通常切片厚度為3-5um，用毛筆輕托輕放在37度水浴中展片。

7.貼片與烤片：

一般使用恆溫水浴鍋，溫度控制在37-40℃左右，有利於石蠟切片的展開，貼好的切片置於60℃恆溫箱內乾燥2小時，蛋白質凝固後即可染色。

8.切片脫蠟及水化：

乾燥後的切片置於二甲苯中進行脫蠟，然後依次使用從高濃度到低濃度遞減的順序進行經純酒精、95%、85%、70%進行水化。

9.染色：

經典的蘇木精和伊紅：細胞核被蘇木精染成紫藍色，多數細胞質及非細胞成分被伊紅染成粉紅色。實驗操作簡單。

免疫組化：指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應。

二、冰凍切片

1.取材：

應儘可能快地採取新鮮的材料，防止組織發生死後變化。

2.速凍：

1）將組織塊平放於軟塑瓶蓋或特製小盒內（直徑約2cm）。

2）如組織塊小可適量加OCT包埋劑浸沒組織，然後將特製小盒緩緩平放入盛有液氮的小杯內。

3）當盒底部接觸液氮時即開始氣化沸騰，此時小盒保持原位切勿浸入液氮中，大約10-20s組織即迅速冰結成塊。

4）在製成凍塊後，即可置入恆冷箱切片機冰凍切片。

5）若需要保存，應快速以鋁箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱貯存備用。

3.固定：

1）樣品托上塗一層OCT包埋膠，將速凍組織置於其上，4℃冰箱預冷5-10min讓OCT膠浸透組織。

2）取下組織置於錫箔或者玻片上，樣品托速凍。

3）組織置於樣品托上，其上再添一層OCT膠，以完全覆蓋為宜，速凍架（PE）上30min。

4.切片：

1）恆溫冰凍切片機為較理想的冰凍切片機，其基本結構是將切片機置於低溫密閉室內，故切片時不受外界溫度和環境影響，可連續切薄片至5-10μm。

2）切片時，低溫室內溫度以-15℃ ~ -20℃為宜，溫度過低組織易破碎，抗卷板的位置及角度要適當，載玻片附貼組織切片，切勿上下移動。

5.免疫熒光染色：

1）冰凍切片室溫晾乾15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室溫封閉切片1小時（此步可不洗）。

2）滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液（抗體的量視組織大小而定，原則是可以均勻覆蓋組織面，且保證整個過程中不會使組織乾涸）。

3）將切片放在加了PBS的免疫組化濕盒，室溫孵育2小時或4℃過夜。

4）第二天先將濕盒放到37℃回溫1h，然後吸取片上的一抗進行回收，將切片插入到小染缸PBS沖洗。

5）滴加用PBS稀釋好的二抗（避光）置於分子雜交箱中37℃孵育1小時。回收二抗，切片置於染缸內，PBS洗5min×3次。

6）滴加DAPI工作液染核，室溫10-20min（工作濃度0.1%染色15min）。

7）回收DAPI，滴加5-10μl抗熒光衰減封片劑或中性樹膠，用處理乾淨的蓋玻片封片，即可到熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

8）做好的切片放在切片盒內，置於4℃冰箱，可保存一周左右。

常見問題及解決方案

1.切片上卷且不能形成連續蠟帶

原因：①切片刀不夠鋒利。②切片刀與蠟快的角度不當。③蠟塊四周留蠟邊太少。④石蠟硬度過大，黏度不夠。

解決方法：①重新磨刀。②調整切片刀的角度。③可重新包埋或將蠟塊四周熔化，再放入包埋框中補蠟，修理蠟塊時組織塊周圍保留的石蠟以2mm左右為宜。④蠟塊過硬可適當加些蜂蠟，或更換熔點較低的石蠟重新包埋。

2.切片彎曲且不能形成直帶

原因：①蠟塊上下或左右兩邊不平行。②蠟塊與切片刀刀口不平行。③組織塊外形不整齊。④切片刀各處的鋒利程度不一致。

解決方法：①將蠟塊四邊反覆修平對稱。②調節蠟塊夾持器，使其與切片刀平行。③修整組織塊時，注意修切整齊。④移動切片刀，更換刀口位置。

3.切片上出現裂紋

原因：①切片刀上有小缺口，或刀口不平整。②組織中可能含有較硬之物質，如固定液之結晶石灰質。③包埋時石蠟凍結太慢。

解決方法：①切片刀某處有缺口，可調換刀口部位或重新磨刀。刀口上缺口過多且不平整，可先將刀鋒垂直在磨刀石上輕輕磨數次，然後按常規磨刀田。②組織中硬性物質太多，則不宜用。③糾正包埋時的缺點。一般待蠟塊周圍凝結一層，即可放入冷水中。

4.切片粘在切片刀不易取下

原因：切片時有靜電作用，產生靜電吸引，在冬季或氣候乾燥時常出現這種情況。

解決方法：可用加濕器。以增加空氣中的水分，而減少靜電作用。

5.切片厚薄不均

原因：①切片微動部分失靈，齒輪跳格。②蠟塊太大，過硬，轉動時刀刃受震動。

解決方法：①修理切片機失靈的部分，調整螺旋。加機油潤滑零件，必要時需請專業技術人員調整切片機。②如蠟塊過大，以後取材時注意取材的大小。蠟塊組織過硬，可返回水中浸泡，再重新脫水和包埋。

6.切片碎爛或組織脫出並與石蠟分離

原因：①組織脫水，透明不夠。②浸蠟時間過長．浸蠟溫度過高。③組織脫出是由於脫水、透明時間不夠，或組織中含有乙醇等，石蠟不易滲入組織中．故導致石蠟與組織分離。④二甲苯使用時間過久。

解決方法：①必須按組織大小厚薄選擇脫水、透明時間。②依組織的性質和結構特點確定浸蠟時間．控制包埋溫度。一般這種情況難以補救。③脫水，透明滲蠟不夠，應重新熔化，退回入二甲苯和酒精，再進行滲蠟包埋。④更換二甲苯。

7.切片皺褶太多且不能完全展開

原因：①石蠟太軟或室溫過高。②切片刀上粘有殘餘的石蠟，刀口不幹凈。③組織浸蠟時間不夠．或脫水、透明不夠。④切片刀不鋒利。

解決方法：①可將蠟塊放入冰箱中冰凍後切片。並在切片時一邊切片一邊用冰塊冰凍或換蠟。如室溫過高，可開空調降低室溫。②切片刀不幹凈，可用棉花沾少許二甲苯將刀口拭乾凈。③組織浸蠟不夠，可重複浸蠟過程。④將切片刀磨銳利再行切片。

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