攻克ELISA實驗，你需要搞定這些問題

LISA是蛋白定量的金標準，也是免疫學研究中最常用的實驗方法之一。很多人覺得ELISA很簡單，其實不然。東澳生物帶你繞開ELISA實驗中出現的各種問題，輕鬆搞定ELISA實驗~

酶聯免疫吸附實驗

1971年瑞典學者Engvail和Perlmann,荷蘭學者VanWeerman和Schuurs分別報道將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。

酶聯免疫吸附（ELISA）用於：

（1）免疫酶染色各種細胞內成份的定位；

（2）研究抗酶抗體的合成；

（3）顯現微量的免疫沉澱反應；

（4）定量檢測體液中抗原或抗體成份。

優點：快速、靈敏、定性、定量、定位

實驗原理

1.包被：抗原/抗體，固相化

4.底物顯色：定性/定量分析

常用的酶與底物：

酶底物顯色測定波長辣根過氧化物酶horseradish pero

xidase,HRP鄰苯二胺（OPD）橘紅色492nm四甲基聯苯胺（TMB）黃色450nm鹼性磷酸酶alkaline phosohatase,AP4-硝基酚磷酸鹽(p-NPP)黃色405nm終止液：2mol/L H2SO4

常用方法

1.間接法

優勢：二抗可以加強信號，而且有多種選擇能做不同的測定分析。不加酶標記的一級抗體則能保留它最多的免疫反應性。

缺點：交互反應發生的機率較高

2.雙抗體夾心法

檢測大分子抗原最常用的方法。

優勢：高靈敏、高專一性，抗原無須事先純化。

缺點：抗原一定得擁有兩個以上的抗體結合部位。

3.競爭法

檢測小分子半抗原（藥物、激素等）。

優勢：可適用比較不純的樣本，而且數據再現性很高。

缺點：整體的敏感性和專一性都較差。

常見問題分析

Q1.標曲不顯色或顯色很弱，樣本顯色

溶解標準品以及倍比稀釋時，未渦旋震蕩或不夠充分。

標準品溶解、倍比稀釋時均需要渦旋震蕩以保證充分混勻。單純依靠移液器反覆吹打，效率較低、效果也不一定最佳。

Q2.標曲和樣本均不顯色

在孵育階段靜置在桌面上，這樣非常不利於抗原抗體之間的充分接觸，導致顯色偏弱。

推薦孵育階段，使用ELISA專用的微孔板振蕩器，調至合適的頻率，使抗原抗體充分接觸，保證結合效果。如果排除上述原因，有可能是漏加了某個組分，如檢測抗體、酶等。對於比較馬虎的新手，一定要做好標記和記錄，或者使用添加染料的ELISA試劑盒。

Q3.標曲顯色，樣本不顯色

當樣本中目的蛋白濃度極低或者樣本中干擾因素較強，就無法檢測到。目前ELISA仍然是蛋白檢測靈敏度最高的方法，與不同技術結合後，衍生出了多種類型的ELISA，提高了檢測靈敏度。

對於目的蛋白濃度特別低的樣本，可以嘗試用高敏ELISA，但這也並不意味著一定能檢測到樣本濃度，只能說可以提高樣本的可測率，並使結果更加可靠。因為通常用普通ELISA檢測的樣本OD值都偏低，而高敏ELISA可提高樣本OD值，使之盡量位於標曲範圍內，得到的數值也更加可信。

Q4.標曲和樣本都顯色，但復孔的CV大

這個問題就跟移液器和實驗者的操作有關了。移液器的使用維護不規範，就會造成移液的誤差較大；實驗者自身的操作習慣、加樣的一致性對復孔的CV也有很大影響。

掌握移液器的正確使用和維護。關於個人的操作可練習移液動作、加快速度，確保移液的精密度。

Q5.本底偏高，樣本值測不到

標曲的本底即Blank孔的OD值一般要求控制在0.1以下(對於高敏ELISA可以適當放寬要求)。尤其是樣本值特別低的時候，本底過高會掩蓋目的信號，導致無法測到樣本值。

在加入TMB顯色後，需實時觀察標曲顯色情況。通常在S5孔有肉眼可見的微弱藍色，即可終止反應。

Q6.樣本經不同梯度稀釋，計算得到的樣本值差異較大

有時候我們不清楚樣本中目的蛋白的濃度如何，應該如何稀釋，那麼我們就會做下預實驗，確定稀釋倍數。然而有時候同一樣本做了幾個不同梯度稀釋後，計算得到的樣本值之間差異較大，應該選擇哪一個稀釋倍數呢？

這裡涉及到了基質效應。通常血清樣本加樣量較高時，血清中的各種蛋白會抑制抗原抗體的接觸，基質效應較明顯。而經過稀釋後，干擾因素也隨之稀釋，影響就會較小。當某兩個梯度稀釋後，計算得到的樣本值接近時，我們就可以認為在該稀釋梯度時，樣本中的干擾因素影響較小，計算得到的值也是接近真實的。然而這樣的稀釋是針對目的蛋白濃度較高的樣本而言。對於濃度很低的樣本，經過多倍稀釋後，就更加測不到了，此時可按照廠家說明書推薦的加樣方式操作。

Q7.不同試劑盒中的組分能否通用

除非是公用的試劑如洗液、檢測緩衝液，其它組分不建議用其它試劑盒的組分，甚至是同一指標不同批次的試劑盒裡的組分。這些組分(包括標準品、標準品稀釋液、檢測抗體、酶等)都是經過優化的，如果貿然使用其它試劑盒的組分，有可能對結果產生影響。