原代細胞培養難？金牌實驗員來支招

長期以來，人們認為中樞神經系統成熟的神經元很難或不能在進行分裂和增殖，屬於終末分化細胞。因而中樞神經系統的損傷、變性導致的神經元丟失及缺損難以修復，神經功能的重建被視為幾乎不可能。神經幹細胞在體外分離培養和增殖的成功，為中樞神經系統再生和功能重建提供了新的可能途徑。

「養細胞難、養原代細胞更難、養原代神經幹細胞難上加難！」

今天，東澳金牌實驗員為大家詳細講解原代神經幹細胞取材及培養的那些事，手把手教你輕鬆搞定~

神經幹細胞

神經幹細胞是指具有分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的能力，能自我更新並能提供大量腦組織細胞的細胞群，具有自我更新能力和多向分化潛能，對損傷和疾病具有反應能力。原代培養的單細胞在24h內自動聚集成團，這是神經幹細胞在體外培養過程中的一個重要特徵。

原代取材及培養

步驟一.原代取材：

1.脫頸處死2周齡孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒後，手術剪打開腹腔，取出子宮，剪開子宮，取出胎鼠，置於含冰冷PBS液的10cm培養皿中。

2.將胎鼠斷頭，用眼科剪分離顱骨及硬腦膜，取出腦組織，在顯微鏡下充分取出腦膜和血管組織。

3.將腦組織用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的組織塊，至於含DMEM/F12的離心管中，吸管輕吹打10次，靜置離心管1~2min，取細胞懸液。重複2-3次。

4.細胞懸液以700r/min離心6min,吸除上清，獲得細胞沉澱。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重懸後，過200目篩網，並計數。

5.按5×105/ml密度接種，置於37℃，5%CO2培養。2天後隔天換液。通常一周左右，神經球長出。

步驟二.傳代培養：

1.在光鏡下觀察細胞球中心已出現灰黑色區域時進行傳代，將培養基轉移至15ml離心中，800r/min離心5min，棄上清。

2.加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑製劑終止消化，輕輕吹打神經球至至細胞懸液， 800r/min離心5min，棄上清。

3.加入適量幹細胞培養液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨醯胺），調整細胞濃度為5×105/ml，置於37℃，5%CO2繼續傳代培養。

實驗影響因素

1.供體年齡的影響

實驗研究顯示，胚胎鼠大腦皮質中的神經干數量明顯高於新生鼠，且胎齡為12~15d左右的鼠胚胎體內的神經乾的分化能力最強。

2.分離方法對細胞純度及活力的影響

常用的細胞分離方法有機械分離法和酶消化分離法。機械分離法的缺點是吹力度和次數不易掌控，且機械切割作用會使細胞活性降低；酶消化法缺點是消化的時間不易掌握，並且用於分離神經幹細胞的消化酶對細胞具有潛在的損害作用。

3.接種密度對神經乾的影響

神經幹細胞的適宜接種濃度一般可用1×10*8/L~1×10*9/L，接種細胞密度過小，細胞不成球，不利於細胞增殖；接種細胞密度過大，第一次傳代後很快出現死亡、特大、散亂、單細胞數迅速增多。採用半量換液的方法可以最大程度地使細胞生存環境保持穩定,有利於細胞生長。

4.傳代培養時機的影響

神經幹細胞經過原代培養後中，細胞數量大量增殖，必將導致大部分神經幹細胞因缺乏營養而死亡，因此及時進行傳代是防止其死亡的關鍵，有文獻報道一般選用原代培養5~7 d時進行，既可避免細胞過度增殖而死亡, 又保持細胞增殖的活性。

注意事項

1.為維持取材過程中的細胞活性，在取材整個過程中應都在冰上進行並且在剝離腦膜和血管組織中要在含有10%FBS高糖培養基中，因為胎鼠神經干代謝旺盛，長時間在無糖環境對神經干造成損傷。

2.在取材過程中，不要取一個皮層，剝離一個腦膜血管，而是快速將所有胎鼠皮層取下來，放到高糖培養基中。

3.剝離腦膜及血管應全部分離乾淨，否則在製作單細胞懸液時，會被迫加大吹打力量和次數，造成細胞損傷。

4.在培養過程中，為防止細胞貼壁分化，隔天輕輕晃動培養基。

5.避免細胞污染。加強無菌操作意識，做好實驗室、實驗器械等的消毒工作。