HE染色太簡單？精良之作自帶高級感

HE染色

HE染色即蘇木精－伊紅染色法( hematoxylin-eosin staining )，是石蠟切片技術里常用的染色法之一。蘇木精染液為鹼性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。

一張做工精良的HE切片是病理醫生得以做出正確診斷的關鍵。HE染色是目前國內外病理診斷上廣泛採用的 常規染色方法。切片質量的好壞，可直接影響疾病診斷的及時與準確性。因此，能製作出一張高質量的HE染色切片，是必須掌握的技術之一。

染色原理

1、細胞核染色原理

蘇木精為鹼性天然染料，可使細胞核著色。細胞核內染色質的成分主要是DNA，在DNA的雙螺旋結構中，兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外，使DNA雙螺旋的外側帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木精鹼性燃料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在鹼性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。

2、細胞漿染色原理

細胞漿內主要成分是蛋白質，為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關係，當pH調到蛋白質等電點4.7-5.0時，胞漿對外不顯電性，此時酸或鹼性染料不易染色。當pH調到6.7-6.8時，大於蛋白質的等電點pH值，表現酸性電離，而帶負電荷的陰離子，可被帶正電荷的染料染色，現時胞核也被染色，核和胞漿難以區分。因此必須把pH調至胞漿等電點以下，在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷（陽離子），就可被帶負電荷（陰離子）的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料，在水中離解成帶負電荷的陰離子，與蛋白質的氨基正電荷（陽離子）結合而使細胞漿染色，細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織，嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色，與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

3、分化作用

染色後，用某些特定的溶液將組織過多結合的染色劑脫去，這個過程稱為分化作用，所用的溶液稱為分化液。在HE染色中用0.5%鹽酸乙醇作為分化液，因酸能破壞蘇木精的醌型結構，使組織與色素分離而褪色。經蘇木精染色後，必須用0.5%鹽酸乙醇分化，使細胞核過多結合的蘇木精染料和細胞漿吸附的蘇木精染料脫去，在進行伊紅染色，才能保證細胞核與細胞漿染色的分明。因此，在HE染色中分化是極為關鍵的一步。

4、返藍作用

分化之後，蘇木精在酸性條件下處於紅色離子狀態，呈紅色，在鹼性條件下處於藍色離子狀態，呈藍色。組織切片經0.5%鹽酸乙醇分化後呈紅色或粉紅色，故分化之後，立即用水除去組織切片上的酸而終止分化，再用弱鹼性水（0.2%氨水）使蘇木精染上的細胞核呈現藍色，這個過程稱為返藍作用或藍化作用。另外用自來水浸洗也可使細胞核返藍，但所需時間較長。

染色步驟

——固定液：常用95%乙醇和冰丙酮

——蘇木精染液：稱取蘇木精粉0.5g，銨礬24g溶解於70ml蒸餾水中，然後取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均勻，濾紙過濾，備用。

——伊紅染液：稱取0.5g水溶性伊紅染液，溶於100ml蒸餾水中。

——稀鹽酸乙醇溶液：用75%乙醇配製1%鹽酸。

——系列濃度的乙醇、二甲苯、中性樹膠。

1.樣品製備

對於貼壁生長細胞，胰酶消化，調整細胞濃度約1×105/ml，滴加於蓋玻片上(置於6孔板中)，培養相應時間後，取出細胞爬片，用PBS 洗滌3次。

2.樣品固定

95%乙醇固定20min，PBS洗滌2次，每次1min。

3.染核

蘇木素染液染色2-3min，自來水洗滌。

4.分色

鏡下觀察，若細胞核染色過深，用1%鹽酸酒精溶液分色數秒，自來水洗滌。

5.染胞質

浸入伊紅染液染色1min，自來水洗滌。

6.封片

吹乾或自然晾乾細胞 爬片後，中性樹膠封片。

注意事項

一、pH值的調節

如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色。因此，要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min，這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳，可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

二、分色時間的控制

分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚（晰）而細胞質基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺，應重新染色後再行分色。

三、酒精脫水應徹底

切片經酒精脫水後，入二甲苯時可出現白色不透明狀態，此為脫水不徹底，應將切片退回無水酒精，更換酒精、二甲苯，以求徹底脫水與透明。 切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦乾淨或吸干多餘水分。

四、避免切片乾燥

在染色過程中不要讓切片乾燥，以免切片收縮、變形，影響神經元形態。

五、避免切片污染

出現切片污染，污染物遮蓋該部位的細胞或組織難以觀察期形態改變。應定期過濾各種染液和試劑以避免其中的沉澱物所引起的污染。

六、避免脫蠟不完全

冬季室溫低時（14℃以下），二甲苯應在水浴缸中適當加溫到30℃後再脫蠟，以避免因脫蠟不完全引起的染色不均勻呈霧化狀態。

七、封片注意事項

最後封固時，要用中性樹脂，防止日後褪色，蓋片要選大於組織塊的面積，如漏出一部分不久將會褪色，所用樹脂濃度要適當，樹脂封固時不能有氣泡。