細胞凋亡檢測實驗之《TUNEL染色》

細胞凋亡檢測實驗

熒光探針雙標記法、形態學檢測法、DNA ladder法、Annexin V/PI雙染色法、磷脂醯絲氨酸外翻分析（Annexin法）、TUNEL法、Caspase-3活性檢測法。

TUNLE染色

TUNLE染色即原位末端轉移酶標記技術。凋亡細胞的DNA雙鏈斷裂或一條鏈出現缺口，產生一系列3』-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)作用下，將脫氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物標記到DNA的3′末端，從而進行凋亡細胞的檢測。TUNLE染色是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確的反應細胞凋亡最典型的生物化學和形態特徵。

實驗步驟

使細胞或組織貼在載玻片上?固定?洗滌?通透?洗滌?預平衡?用熒光素12-dUTP標記斷裂的DNA鏈?終止反應?洗滌?封片?分析樣品

關鍵實驗步驟

1.充分脫蠟和水化

脫蠟可以先 60oC 20 min，再用使用二甲苯兩次 5-10 min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便後面的結合反應充分、均勻；

2.把握好細胞通透的時間

一般根據切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時間，常用 10-30 min，幾 μm 切片用短時間；幾十 μm 切片用長時間，通過摸索達到既不脫片，有能夠使後面的酶和抗體進入胞內。

3.適當延長 TUNEL 反應液的時間

一般是37oC 1 h，你也可以根據你的凋亡損傷程度，選擇更長的時間，可長至 2 h，但要結合你最終的背景著色。

4.DAB顯色條件的選擇

一般 DAB 反應10 min 左右，結合鏡下控制背景顏色，最長不超過 30 min；promega 公司提供的 DAB 液（桃紅色），不利於辨認棕褐色，我不太喜歡。

5.PBS的充分清洗

在 TUNEL 反應後和酶標反應後的清洗應十分嚴格，可增加次數達 5 次，因為這些清洗直接決定最後切片的非特異性著色。

6.內源性POD的封閉也十分關鍵

對於肝臟、腎臟等血細胞含量多的組織，我的經驗是適當延長封閉時間和升高過氧化氫的濃度，可以達到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。

注意事項

1.一定要設立陽性和陰性細胞對照。

2.陽性對照的切片可使用DNaseI部分降解的標本，陽性細胞對照可使用地塞米松（1 μM）處理3-4 h的大、小鼠胸腺細胞或人外周血淋巴細胞。

3.陰性對照不加TdT酶，其餘步驟與實驗組相同。

4.復染的目的是為了襯托組織形態結構，以利於結果分析，石蠟切片常用蘇木素，核染成蘭色，冷凍切片常用甲基綠，核染成綠色。

5.PBS 用蒸餾水、Na2HPO4、KH2PO4配製，現在有賣的，自己加蒸餾水稀釋後即可用，很方便，也不貴。

6.蛋白酶 K 消化蛋白後，需要用封閉液。

7.TUNEL反應液臨用前配製，短時間在冰上保存。不宜長期保存，長期保存會導酶活性的失活。

8.如果20×DAB 溶液顏色變深成為紫色，則不可使用，需重新配製。

東澳服務

服務項目：

對各類組織樣品的組織切片做凋亡檢測。

實驗流程：

脫蠟水化→固定→洗滌→通透→洗滌→預平衡→用熒光素-12dUTP標記DNA斷鏈→終止反應→封片鏡檢

示例：