高效製備感受態

在科研實驗中，為了獲得純的重組質粒DNA，需要允許外源DNA分子進入的細胞。經過一些特殊方法（電擊法、CaCl2法）等處理後，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的細胞，即感受態細胞。

回顧2017,

東澳生物最暢銷的產品當屬

感受態和MCAO線栓

製作感受態很簡單卻非常麻煩

東澳生物實驗室

出廠的每一支感受態都備受好評，

實驗室的達人小夥伴兒們

告訴你，

怎樣高效製備感受態~

基本製備步驟

1.從37℃培養16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm)，轉到一個含有100 ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養3 h。一般經驗，1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。

2.將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50 ml聚丙烯管中，在冰上放置10 min，使培養物冷卻至0℃。

3.於4℃用Sorvall GS3特頭（或與之相當的轉頭）以4 100 r/min離心10 min，以回收細胞。

4.倒出培養液，將管倒置1 min以使最後的痕量培養液流盡。

5.每50 ml初始培養液用30 ml預冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2，20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉澱。

6.於4℃用Sorvall GS3轉頭（或與之相當的轉頭）以41 00 r/min離心10 min，以回收細胞。

7.倒出培養液，將管倒置1 min以使最後的痕量培養液流盡。

8.每50 ml初始培養物用2 ml用冰預冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉澱。

9.此時，可以用新鮮製備的感受態細胞直接做轉化實驗，也可以將細胞凍存於- 70℃。

潔凈是最重要的~

無菌都無所謂，在操作台上可正常操作。離心力要注意不要超過2500g,建議1500-2000g 5min。

塗板要注意，不要覺得不勻而多次反覆。

輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可，特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴2小時以上的板。塗完後建議空氣晾乾（20-30分鐘）這樣會減少衛星菌落出現。

預冷是必要的。

整個過程的低溫也並非特別重要，只要注意就行了，我在去殘液時經常在室溫倒置1min，對感受態效率提高有幫助，第一次多加一點緩衝液，我經常加至20ml，效果不錯。

關於感受態的製備方法~

關於大腸桿菌的感受態製備及轉化的方法很多，最複雜的莫過於電轉化，而最簡單的則是將LB平板上的菌落直接挑入裝有緩衝液的EP管冰箱即開始轉化。對於做克隆工作的人而言，高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。

省心、省時，又省力

東澳生物

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畢竟，開學季大回饋就要來了！！

[東澳]大腸桿菌感受態列表

BL21(DE3)chemically Competent Cell

產品特點：BL21菌株用於以T7 RNA聚合酶為表達系統的高效外源基因的蛋白表達宿主。T7噬菌體RNA聚合酶基因的表達受控於λ噬菌體DE3區的lacUV5啟動子，該區整合於BL21的染色體上。該菌適合於非毒性蛋白的表達。

DH5α Chemically Competent Cell

產品特點：大腸桿菌DH5α是一種常用於質粒克隆的菌株，在使用pUC系列質粒載體轉化時，可與載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現α-互補。可用於藍白斑篩選鑒別重組菌株。

STBL3 Chemically Competent Cell

產品特點：STBL3感受態細胞是慢病毒載體系統推薦使用的菌株，可有效抑制長片段末端重複區的重組，降低錯誤重組的概率。

Top 10 Chemically Competent Cell

產品特點：TOP10感受態細胞是一種常用於質粒克隆的菌株，適用於高效的質粒DNA克隆並能保證高拷貝質粒的穩定複製。

使用方法：

1 從-70℃ 超低溫冰箱中取出一管感受態菌，冰浴10 min使其解凍；

2 加入適量目的質粒DNA，冰浴30 min；

3 插入42℃水浴中90S進行熱休克，然後冰浴5 min；

4 加入0.7ml無抗LB培養基（培養基預熱至37℃），然後37℃ 160-180rpm/min震蕩培養45-60min；

5 取上述轉化混合液100-300μl，在含合適抗菌素的固體LB平板培養皿上用玻璃塗布棒塗布均勻；

6 *如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話，滴完菌液後再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，塗布均勻；

7 放入37℃恆溫培養箱倒置培養過夜；

8 觀察平板上長出的菌落克隆