神經幹細胞的培養方法及其優缺點是什麼？

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近年來，神經幹細胞(neural stem cell, NSC)研究為神經發育機制的闡明、神經系統疾病的臨床治療、藥物的神經毒性評價[1]提供了嶄新的思路和方法。

由於NSC體外培養要求高、培養過程中易分化及其生物學特性尚未完全闡明等原因，NSC的各種培養方法總是存在不足。目前，培養NSC的途徑主要有:從神經組織分離培養、從胚胎幹細胞（embryonic stem cells， ESC）等其它組織來源的幹細胞誘導獲得、從永生化的NSC獲得這3種方法。

1.NSC的概念、基本特徵

自從1992年Reynolds等[2]首次成功分離並提出了NSC的概念以來，由於其細胞功能的多樣性和缺乏理想的細胞標誌物，NSC的定義一直停留在功能學特徵的定義：指能自我更新，並且能分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等的細胞。

NSC的生物學特性為:①自我更新能力：自我複製和增殖分裂能力;②多向分化潛能：能分化成神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等多種細胞;③對損傷和疾病具有反應能力;④這種自我更新能力和多分化潛能可長時間維持。

2.NSC的培養方法及其優缺點 2.1從神經組織分離培養

分離培養NSC的經典方法是從新生動物或胚胎的神經組織中有NSC分布的某一區域分離細胞，如室管膜下區/海馬或胚胎腦的大多數結構。採用機械法或酶消化法分散組織獲取細胞，以含高濃度有絲分裂原如鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF/FGF-2)和/或表皮生長因子(EGF)的無血清培養基進行培養。NSC培養方法按生長方式分為懸浮培養法（又可分為傳統神經球法、集落形成法）和貼壁培養法。

2.1.1傳統神經球法 1992年，Reynolds等[2]率先採用神經球法建立了NSC的培養方法。具體方法：①組織取材後經酶解消化，經機械吹散後，調整活細胞濃度為5000~10000/ml，置於未包被的培養皿中培養，在基礎培養基DMEM/F 12 (1: 1)中加入人重組EGF和bFGF各20 ng/ml。培養皿中大部分細胞於2d後死亡，但有少量可繼續分裂、增殖，形成細胞球，即神經球，幾乎都是Nestin(+)。

優點：由於方法簡單，只要嚴格按照程序操作重現性就很好。神經球法是分離、擴增和研究胚胎和成體NSC最常用的方法[3]。

缺點：①神經球形成過程中除發生細胞增殖外，還存在融合現象[4]。②神經球並非全部只來自NSC，NSC和神經前體細胞的增殖均能形成神經球[5]。③神經球是一個異質性結構[6] [7]。

2.1.2集落形成法為了區分NSC和神經前體細胞增殖形成的克隆，Louis等[8]建立了神經集落形成細胞實驗。具體方法：該法採用無血清培養基，以克隆密度將神經細胞接種至半固態膠原基質以確保克隆性，培養3-4周至細胞形成大小不同的克隆，因為NSC與神經前體細胞相比表現出更強的增殖能力，只有直徑大的克隆(如大於2mm)才具有幹細胞特徵。

優點：在很大程度上區分了NSC與神經前體細胞形成的克隆，更適合用於評價NSC的增殖能力和定量分析。

缺點：與神經球法一樣仍屬於懸浮培養，不利於進行細胞形態學的觀察。

2.1.3貼壁培養法近來研究發現NSC不僅能在貼壁劑包被過的表面貼壁生長，也能在按照特定程序培養傳代後在未處理過的表面貼壁生長，得到同質性更高的幹細胞群[9]。RAY[10]等將胚胎海馬來源的細胞接種於多聚鳥氨酸和粘連蛋白包被的細胞培養板，以含DMEM /F-12, N2和bFGF的培養基培養，得到能連續傳代(>5個月)的nestin陽性細胞。WAKEMAN等[9]建立了人胚來源NSC的多層貼壁網路，NSC可直接貼附在培養表面而不需要貼片劑的包被。獲得細胞能克降生長、對稱分裂、同質化程度高，可作為純化的NSC來源。

優點：與懸浮培養法相比，貼壁培養法更利於進行細胞形態學的觀察，獲取大量同質化的細胞。

缺點：當使用某些貼片劑時可能會誘導NSC的分化，也可能會干擾某些研究結果。 2.2從ESC等其它組織來源的幹細胞誘導獲得

NSC還可由ESC、間充質幹細胞、誘導性多能幹細胞等來源的幹細胞在一定條件下誘導分化獲得。ZHANG等[11]的研究發現，以擬胚體形式生長的ESC在添加bFGF的培養基中能夠分化為Nestin和Musashi-1表達陽性的NSC，以及分化的神經元和膠質細胞，利用酶處理後細胞貼壁性的差異能夠得到純化的具有分化能力的NSC。

優點：來源廣泛，自體移植不存在免疫排斥。能在體內與受體神經組織很好地整合，真正實現神經再生與功能修復[12]。

缺點：存在倫理學爭議，尤其是胚胎幹細胞的獲取會損傷胚胎。 2.3從永生化的NSC獲得

永生化NSC是指在體外利用逆轉錄病毒使癌基因等轉染NSC，使之能夠保持持續增殖狀態。如c-myc和SV-40大T抗原是NSC永生化轉染時最常用的兩種癌基因。由於永生化過程中轉入基因的不同，培養基成分也有很大差異。一些仍需要無血清培養基和bFGF和EGF等生長因子的維持，一些在含有血清的培養基中也能夠自我更新。

優點：無限傳代，細胞產量大，原材料的獲取成本較低。

缺點：①可能發生遺傳學差異，具有潛在的致瘤性。②生物學特性存在差異。利用生物學實驗、基因晶元、逆轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)、免疫細胞化學等技術發現，C17. 2與其來源於的NSC和小腦顆粒層前體細胞顯著不同[13]。