dCas9技術流程與實驗問題解決方案

實驗步驟

1設計sgRNA

按照「20N+NGG(PAM)」的設計原理設計sgRNA，至少設計3條。

2構建sgRNA和dCas9-target 質粒

3、構建dCas9-target穩轉株

穩轉株蛋白構建完成後，用flag抗體或目的蛋白抗體檢測穩轉株是否構建成功，如果載體上有熒光蛋白，可用熒光檢測細胞株是否構建成功。

圖3 熒光檢測圖片 A轉染篩選後明場圖片 B轉染篩選後熒光圖片 C未轉染加嘌呤篩選細胞

四、Flag-ChIP-QPCR驗證sgRNA的工作效率

實驗問題與解決方案

1怎樣避免sgRNA脫靶?

脫靶效應與sgRNA的精確設計有著密切的關係，一般的sgRNA設計網站都會給出設計序列相應的脫靶位點、GC含量或綜合得分。我們一定要選擇綜合得分高和脫靶位點少的sgRNA序列，且一般至少設計3條sgRNA。

2怎樣選擇CRISPR系統？

如果要靶標多個基因位點，建議您選擇CRISPR-cpf1系統，這個系統的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上，一個sgRNA載體可同時插入多個sgRNA。

如果要更精確的編譯基因組，建議選擇Cas9 nicknase，這個蛋白是Cas9的突變體，只切割DNA的一條鏈，因此，這個系統需要設計兩個sgRNA，同時切割，才能產生DNA雙鏈缺口。同時，這種方法大大降低了脫靶效應。

3 Cas9的單切系統和雙切系統是什麼？

Cas9的雙切系統是未突變的Cas9內切酶，Cas9內切酶可以切割雙鏈DNA。Cas9

的單切系統使用的是單突變Cas9內切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要兩套才可以切割雙鏈DNA。

4 怎樣選擇CRISPR系統的質粒？

如果您的細胞的轉染效率較高，可使用普通載體，如果您的細胞不容易轉染，建議使用腺病毒或慢病毒載體。

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