基因轉錄後加工中可變剪切與circRNA形成機制

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2月14日，Gene雜誌在線發表了俄羅斯科學院分子遺傳研究所Ivan B. Filippenkov為通訊作者的文章，介紹鞘磷脂合酶1（SMS1）基因可變剪切與circRNA形成機制的研究工作[1]。

當基因中包含超長的內含子時（長度大於20kb），RNA拼接過程將呈現為多步拼接的方式（multi-step splicing），其中會出現遞歸外顯子（recursive exon，RS-exon）。遞歸外顯子可能被最終完全切除，也可能會保留到最終的成熟產物中。絕大部分攜帶RS-exon的轉錄終產物會經過胞內nonsense-mediated decay途徑降解，但也有一些基因會保留它們。

SMS1基因總長度達到320kb，包括至少20個外顯子，編碼區位於外顯子7-11。作者之前研究曾發現該基因具有可變的啟動子和Poly(A)信號，也包含攜帶RS-exon的轉錄終產物，其中包括攜帶RS-exon的circRNA分子。

圖1 SMS1基因已報道的外顯子拼接方式 （來自[1]）

本文主要基於靶向捕獲測序技術（RNA-Capture Seq）分析了SMS1基因的轉錄產物，發現了一些新的外顯子和可變剪切形式以及組織特異性的可變剪切和circRNA形成有關的現象。本文的結果有助於增加對組織特異性circRNA表達以及circRNA可變剪切的形成機制的認識。

本文作者發現的SMS1基因遞歸外顯子信息列表如下：

表1 SMS1基因來源遞歸外顯子信息 （來自[1]）

作者如何研究和發現這些遞歸外顯子的？

RNA-Capture Seq是一種外顯子測序技術，概括而言，就是基於已知的外顯子序列設計靶向捕獲探針，分離特定的RNA片段並擴增富集，然後進行高通量測序分析[2]。

圖2 RNA-Capture Seq技術 （來自[2]）

基於RNA-Capture Seq測序分析，在測序結果中發現98%的Reads mapping到了SMS1基因的內含子區域。為方便探討可變剪切的機制，作者挑選了不含重複序列的區域，選擇1-11外顯子的區域進行深入分析。本文作者在前額葉皮質組織中發現了13種新的可變剪切方式，其中12種包含了內含子中來源的外顯子序列，1種新的位於5』區域上游的序列，稱為U1外顯子。白細胞中則發現了15種新的可變剪切形式，其中8種包含了內含子來源的序列，4種為丟失某個外顯子的形式，還有3種包含了上游的新外顯子序列（U1, U2, U3）。

從兩種樣品的測序結果中除了內含子4, 9和10種沒有發現新的外顯子序列外，其餘的內含子中都包含有可保留為外顯子序列的片段。大腦前額葉皮質和白細胞樣品的測序結果中內含子1，3和8的可變剪切方式有非常大的差別。

圖3 人類大腦前額葉皮質和白細胞中SMS1基因可變剪切差異 （來自[1]）

上述的分析結果是基於高通量測序的，需要進行RT-QPCR驗證分析。作者設計了不同可變剪切體對應外顯子的引物，進行了半定量PCR和QPCR分析，證明了對應的可變剪切產物的存在。

圖4 SMS1基因可變剪切的PCR驗證（來自[1]）

SMS1基因的遞歸外顯子也可在對應circRNA中存在

作者在之前的研究中就曾發現SMS1基因的遞歸外顯子（2c, 3c和7b）可最終保留在對應的circRNA分子中。本文新發現的遞歸外顯子是否也可存在與circRNA中？作者通過RNase R消化的方式鑒定到這些遞歸外顯子的確可以在circRNA產物中存在。作者還在更多組織來源的RNA樣品中進行了分析，結果表明特定的circRNA在不同組織中的表達差異非常明顯。

圖5 遞歸外顯子也可在circRNA中存在（來自[1]）

根據已報道的和本文的發現，作者描繪出了SMS1基因來源的circRNA形成示意圖。

圖6 SMS1基因來源的circRNA（來自[1]）

基於這些circRNA所對應的內含子，作者描繪了SMS1基因通過多步拼接的方式形成circRNA的機制示意圖。

圖6 SMS1基因來源的circRNA形成機制（來自[1]）

SMS1基因的遞歸外顯子在大鼠和小鼠中保守

在UCSC資料庫中作者分析了人類SMS1的遞歸外顯子2d, 3c, 3e 和7b在大鼠和小鼠中的保守性，發現這些外顯子均非常保守。RT-QPCR也驗證了在大鼠和小鼠腦組織來源的RNA中可檢測出對應的可變剪切產物。

本文是基因可變剪切的研究報道，其中涉及到了circRNA的可變剪切問題。從本文的結果來看，circRNA的形成過程是基因轉錄過程伴生的，circRNA中存在的可變剪切外顯子或許也是線性RNA剪切過程中會出現的過渡形式所攜帶的。這為深入理解基因的可變剪切，circRNA的可變剪切，組織特異性的可變剪切和表達狀態提供了非常好的借鑒。

參考文獻：

1. Filippenkov, I.B., et al., Multi-step splicing of sphingomyelin synthase linear and circular RNAs. Gene, 2018.

2. Clark, M.B., et al., Quantitative gene profiling of long noncoding RNAs with targeted RNA sequencing. Nat Methods, 2015. 12(4): p. 339-42.

文章：circRNA微信公眾號|吉賽生物

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