重組質粒陽性克隆率很低。？

02-20

我將2300 bp的目的片段與pMD19-T載體過夜連接，之後用連接產物轉化DH5α感受態細胞，塗到抗生素平板上篩選。挑菌-抽提質粒，電泳鑒定結果顯示3條非特異性條帶，分別在500，750，1000 bp處。之前逆轉錄產物的PCR產物直接測序，測序結果顯示是單一且正確的，為什麼連接之後就P不出來了呢？還請大神指點！

謝邀。

首先，正常情況下plasmid抽出來就是三個條帶。那應該是plasmid的抽提以後的三種類型：開環、線性、超螺旋。但是線性的條帶長度，即使是載體自連，應該在2700左右，你為什麼會跑出奇怪的長度可以想像的原因不是沒有，但我沒法證實。質粒抽提產物條帶位置錯位是常見現象，一般三個條帶如果清晰且亮度比例正常（分子量最小條帶明顯更亮）的話還是被認為是單克隆質粒。

其次，克隆失敗在新手當中並不罕見，但是以我帶過的學弟妹的經驗，無論大陸還是台灣，大家一般栽在非常奇怪的理由上，你提供的信息不足以做trouble shooting。我也不知道你做這個有多少經驗，如果你是新手，那麼什麼原因都有可能，如果你是熟練老磚工，那麼很可能是PCR非特異擴增問題。

pMD19T是藍白斑篩選載體，如果你遇到是假陽性（白斑PCR無條帶）。你就直接挑白斑用MCS上游的載體通用引物測序是最快的trouble shooting方法。

另外，所有關於T載體克隆的問題，都要說明是用了哪種酶做的PCR，不是所有聚合酶都可以做T載體克隆。

最後，我還要追問一個很重要的問題：你克隆的片段是什麼片段，在E. coli中是否會表達任何產物？

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@Lophorina質疑我兩個點都是不成立的，作為一個靠做克隆吃飯的老磚工，我「實名反對」一下：

1、在合成生物學中，插入序列經常是完整的轉錄單位。因為經常需要自己設計啟動子、RBS、終止子等元件，很少使用現成的載體自帶的轉錄元件。這是我們學科的特點決定的思維方式，在我們的概念里，想表達什麼蛋白從來不考慮載體是否自帶轉錄裝置。T載體有時被用來克隆誘導表達的完整基因線路，既然是誘導，就一定會有滲漏表達，有的時候是會造成克隆過程中的異常， @Lophorina 在反對我的時候太急了，顯然沒考慮到這種思維差異。我覺得見得少是可以理解的，但是堅決不承認，還說「合成生物學不是分子生物學主流」，這種邏輯我很無語。

2、關於三個條帶的問題，是來自於我的經驗，不是什麼誤區。確實大部分情況下應該只能看到兩個明顯的條帶，但抽提質量不好的情況下確實是會出現三個條帶，我電腦里就能找出膠圖來證明。至於plasmid抽提產物線性條帶與單酶切條帶長度不一致，這是常見現象。原因不是什麼「線性條帶是誤區」，有可能不同形態的DNA相互勾連形成的，其中當然會含有線性DNA，也有可能是plasmid抽提後不純或溶劑等因素造成的，實際上經常實驗的人會發現並非每次都不一樣。對方在這個問題上拿出5個條帶的情況說事兒，說是DNA二級結構造成的，按照這個邏輯，環形DNA有摺疊，線性DNA難道就沒有摺疊了？5個條帶並不是什麼常見現象，有經驗的人會說首先說膠做得太厚或者「非單」造成的。其次才考慮其它問題。

最後對 @Lophorina的答案給一些建議，雙酶切實驗是可行的做法。PCR模板濃度太高也確實是PCR失敗的常見原因。但是連接比例影響的是連接反應的效率和成功率，在題主已經提到有陽性克隆出現的情況下，這個因素可能性不太大。另外我個人的建議與之不同，我建議摩爾數比例控制在1:3-1:5，這是一年數百次連接實驗的經驗。

實名反對 @Yang Liu

1. 鹼抽提法的三個條帶中沒有線性化。我做過酶切實驗，線性化的條帶與質粒的三條條帶的位置都不一樣。三條帶裡面有線性化條帶是一個一直以來的誤區。

2.T載除了藍白斑和抗性之外，不包含原核表達體系，不可能在E. coli中表達。

如果PCR失敗，那麼需要排除質粒濃度太高的問題，質粒的量太大了很容易PCR失敗。最好控制在1pg到10pg。

三個條帶的位置都比較奇怪，上個跑膠圖。

做個雙酶切實驗，看看能不能切出來2.3KB和T載的兩個條帶。

再有可能是第一步酶切的問題以及連接的問題，2.3kb需要和T載的比例控制在1:2-10。

當然還是很有可能是實驗設計問題。

呵呵是用什麼酶做的PCR呢,Taq酶還是高保真酶？為什麼要抽提質粒而不是直接菌液PCR驗證然後測序呢?

有可能P到基因組

手機看不見圖片不知道你的膠什麼樣沒做過藍白和線性DNA

一點點淺顯看法

如果這個方法是現成的只是去重複前人經驗

一般跑膠都會設置control groups

比如你PCR產物

Vector

過去成功轉染，從DH5α裡面提取的plasmid

甚至是沒有轉染前的E. Coli 也同樣步驟提取做參照

這樣至少可以快速排除膠的問題排除複製操作問題

然後再進一步分析

一點點排除

信息比較少。很難給你精準的答案。

根據你提供的信息，試著分析。

連接之後，P不出來條帶，而且質粒提取跑膠結果不符合預期。如果，你的連接之後，驗證的PCR體系確實沒有問題，我推測，你在抗性板上挑的克隆有誤。

你的抗性版是否加了藍白斑篩選，如果沒有加藍白斑篩選，只是挑了有抗性的克隆，風險很大；需要進行藍白斑篩選。