circRNA再顯神通：干擾RNA設計成環形可有助於降低脫靶效應！
1月13日，Molecular Therapy: Nucleic Acids（影響因子6.39）在線發表了北京大學藥學院湯新景教授課題組的最新文章，報道發現將干擾RNA的一條設計為閉合環狀的形態將有助於提高特異性和延長作用能力，降低脫靶效應(Liangliang Zhang 2018)。這一研究報道預示著未來circRNA或許可以直接成為有效的核酸藥物！
脫靶效應一直是干擾RNA有效發揮作用的最大問題之一，本文獨闢蹊徑，嘗試直接將siRNA的一條鏈設計成環狀的形式，另一條鏈仍為線性（circ-siRNA），預實驗結果表明這種形式的siRNA不僅可以有效降低靶mRNA，還能實現鏈特異性的干擾效果。體內實驗也表明circ-siRNA的作用時間更持久。作者是怎麼設計和驗證circ-siRNA的作用的？下面就讓我們一起學習一下：
為什麼設計成circ-siRNA 形式？
為了提高siRNA的作用，很多科學家曾設計出非常多的奇特分子形式。如下圖所示， 「改良版」的設計包括一條鏈兩端均加長的不對稱siRNA，一對二的sisiRNA，已經廣泛使用的髮夾RNA，直接將兩條鏈設計到同一個circRNA閉環分子的啞鈴型RNA以及各種在siRNA的末端添加化學修飾以穩定siRNA分子的嘗試。本文作者嘗試了將一條鏈設計為circRNA形式。另一條鏈仍為線性RNA的環狀干擾RNA（circ-siRNA）。
圖1 不同形式的「改良版」siRNA設計 （來自(Liangliang Zhang 2018)）
這種circ-siRNA是如何合成和鑒定的？作者的方案是按照常規的化學合成法其中的一條鏈，用T4連接酶將其5』和3』端連接到一起。將另一條鏈通過高溫退火的方法互補匹配上去，就形成了circ-siRNA分子。環化與否的單鏈分子可以通過非變性膠電泳分辨出來。
圖2 非變性膠分離環化與否的單鏈RNA分子（來自(Liangliang Zhang 2018)）
c-GS：環化的靶向GFP的正義鏈單鏈；c-GAS：環化的靶向GFP的反義鏈單鏈；GS：非環化的靶向GFP的正義鏈單鏈；GAS：非環化的靶向GFP的正義鏈單鏈。
Circ-siRNA的作用效果如何？
為了分析作者提出的circ-siRNA的效果，作者分別設計了靶向GFP的環形和線性RNA單鏈，然後進行組合，分析它們的干擾效果。在穩定性方面，靶向GFP的circ-siRNA（c-GAS/GS）比傳統的siRNA（GAS/GS）更抵抗RNase A的消化作用。
圖3 circ-siRNA更耐受RNase消化 （來自(Liangliang Zhang 2018)）
各種線性和環形單鏈RNA的組合分析度靶基因的干擾效果，結果表明正義鏈為circRNA，反義鏈為liner RNA形式的組合效果最佳。
圖4 正義鏈為circRNA的circ-siRNA的干擾效果最佳 （來自(Liangliang Zhang 2018)）
除了正反鏈的組合，作者也分析了RNA的長度對效果的影響，選擇用熒光素酶進行分析。結果表明正義鏈為21個鹼基，反義鏈為24個鹼基的組合效果較好。
圖5 長度對circ-siRNA的干擾效果的影響 （來自(Liangliang Zhang 2018)）
為分析circ-siRNA的脫靶效應，作者設計了在熒光素酶報告基因的上游添加正義鏈和反義鏈的靶序列，看不同組合對鏈選擇性的影響。結果表明，正義鏈為21個鹼基的環形RNA，反義鏈為24個鹼基的線性RNA的組合形式能夠有效的選擇性靶向特定序列，而對互補鏈的作用非常微弱，顯示了很強的鏈特異性干擾效果。
圖6 circ-siRNA具有鏈特異性的干擾效果 （來自(Liangliang Zhang 2018)）
Circ-siRNA在體內的作用效果如何？
上述實驗表明在細胞模型中，正義鏈為21個鹼基的環形RNA，反義鏈為24個鹼基的線性RNA的組合形式不僅能有效干擾靶分子，還能有鏈選擇性的特徵。傳統的siRNA雙鏈很難實現只針對一條鏈特異性起作用，而對反義鏈沒有作用。本文的circ-siRNA則具有這一特性。那麼這種設計方案在體內效果怎樣呢？作者構建了GFP表達的U87細胞進行分析，結果表明circ-siRNA的作用更持久。
圖7 circ-siRNA在體內的作用更持久（來自(Liangliang Zhang 2018)）
本文的工作非常有意義，提供了全新的干擾RNA設計思路，尤其是針對同時存在正義鏈和反義鏈轉錄產物的問題，傳統的siRNA方案存在對另一種分子形式的脫靶作用，而正義鏈為21個鹼基的環形RNA，反義鏈為24個鹼基的線性RNA的siRNA分子形式則可以實現鏈特異性的干擾作用。為未來開發有效的基於circ-siRNA的核酸藥物設計提供了全新的思路。
參考文獻：
Liangliang Zhang, D. L., Changmai Chen, Yuan Wang, Gubu Amu, Jiali Yang, Lijia Yu, Ivan J. Dmochowski, and Xinjing Tang (2018). "Circular siRNAs for Reducing Off-Target Effects and Enhancing Long-Term Gene Silencing in Cells and Mice." Molecular Therapy: Nucleic Acids.
文章：circRNA微信公眾號|吉賽生物
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