circHECTD1參與矽肺的病理機制
1月1日，知名雜誌Theranostics（影響因子8.854）在線發表了東南大學醫學院巢傑教授為通訊作者的文章，介紹發現circRNA參與二氧化硅誘導的矽肺病理機制(Zhou et al., 2018)。姚紅紅教授為共同作者之一。
作者通過構建二氧化硅誘導的矽肺小鼠模型篩選相關的circRNA分子，發現circHECTD1在矽肺模型中出現顯著的顯著下調，該circRNA分子所對應的基因HECTD1已報道參與與矽肺的發生過程，因此本文重點探索該circRNA分子的作用情況。分別分析了體外二氧化硅處理的細胞模型中circHECTD1的表達情況，circHECTD1與巨噬細胞活化通路的關係，相關分子機制的探索以及病人標本中的檢測和驗證。
如何找到circHECTD1的？
利用二氧化硅誘導的小鼠矽肺模型，分析特徵性變化的circRNA分子，找到了120種差異明顯的circRNA分子，其中73種為上調。circHECTD1便在明顯下調的circRNA分子中，由於已報道HECTD1基因可能與矽肺的發生有關，因此作者將研究的重點放在circHECTD1分子上。HECTD1是一種泛素化修飾的E3連接酶，主要負責識別特定泛素化底物，實現特異性降解目標蛋白分子。
圖1 小鼠矽肺模型差異表達circRNA分析 （摘自(Zhou et al., 2018)）
體外驗證circHECTD1與矽肺的關係
矽肺往往伴隨著肺泡巨噬細胞的活化，作者利用小鼠巨噬細胞系RAW264.7進行二氧化硅處理，模擬體內巨噬細胞活化的作用過程。結果表明伴隨著二氧化硅的處理，circHECTD1出現時間梯度的下降趨勢。
圖2 二氧化硅處理誘導circHECTD1表達下調（摘自(Zhou et al., 2018)）
circHECTD1參與調控巨噬細胞的活化作用
在RAW264.7細胞中過表達circHECTD1可緩解二氧化硅處理的效應。二氧化硅處理後RAW264.7細胞會在不同時間出現M1型或M2型的活化狀態，但過表達circHECTD1可以緩解該作用過程。
圖3 circHECTD1緩解二氧化硅誘導的巨噬細胞活化作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
ZC3H12A參與circHECTD1介導的巨噬細胞活化調控作用途徑
通過過表達和干擾實驗證明ZC3H12A與二氧化硅介導的巨噬細胞活化作用有關，ZC3H12A通過結合circHECTD1而非HECTD1的mRNA發揮作用。
圖4 ZC3H12A直接結合circHECTD1發揮作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
二氧化硅可誘導HECTD1的表達
二氧化硅處理後RAW264.7細胞中HECTD1蛋白水平的增高，也可直接誘導HECTD1的mRNA表達增高。在小鼠體內矽肺模型中也得到了驗證。
圖5 二氧化硅誘導促進HECTD1表達（摘自(Zhou et al., 2018)）
HECTD1 蛋白參與circHECTD1介導的巨噬細胞活化作用
過表達circHECTD1不直接影響線性的HECTD1的mRNA水平，但能明顯降低HECTD1的蛋白水平。基於Cas-9基因打靶技術，作者設計了兩種認為干預HECTD1蛋白水平的條件：ACT條件下促進HECTD1蛋白的表達，NIC則抑制HECTD1蛋白的表達。作者首先分析了這兩種條件下巨噬細胞活化狀態的差別。結果表明，過表達HECTD1蛋白的情況能促進M1和M2兩種活化方式，而降低HECTD1蛋白水平則可顯著激活M1型活化，抑制M2型活化作用。在二氧化硅處理條件下，過表達HECTD1蛋白能促進M1型活化，抑制HECTD1蛋白則不能產生該效應。說明HECTD1蛋白參與了二氧化硅誘導的巨噬細胞活化作用過程。結合過表達circHECTD1可以顯著抑制HECTD1蛋白的表達水平的結果，在二氧化硅處理的條件下，circHECTD1表達下調，促進了HECTD1蛋白的水平，進而促進了巨噬細胞的活化。
圖6 HECTD1 蛋白參與circHECTD1介導的巨噬細胞活化作用（摘自(Zhou et al., 2018)）
HECTD1介導ZC3H12A的泛素化作用
由於HECTD1是一種E3連接酶，有沒有可能介導了ZC3H12A的泛素化作用？實驗證明了該假設。基於CoIP實驗證明HECTD1與ZC3H12A可相互作用。二氧化硅處理條件下，過表達HECTD1促進ZC3H12A的泛素化，抑制HECTD1則抑制ZC3H12A泛素化。
圖7 HECTD1介導ZC3H12A的泛素化（摘自(Zhou et al., 2018)）
二氧化硅誘導HECTD1的升高與肺纖維化作用有關
二氧化硅刺激所導致的肺部纖維化是矽肺的重要病理特徵，上述結果表明HECTD1蛋白在該過程中扮演了重要角色，有沒有可能HECTD1與該病理變化也有關係？基於劃痕實驗，Transwell實驗表明巨噬細胞經過二氧化硅處理後遷移能力明顯增加，但在基於Cas-9介導的過表達和降低HECTD1蛋白的實驗表明，HECTD1蛋白參與了該病理過程。
圖8 HECTD1的升高與肺纖維化作用有關（摘自(Zhou et al., 2018)）
矽肺臨床患者HECTD1蛋白增高
在臨床標本中，作者分析了HECTD1蛋白表達情況，結果表明矽肺患者來源的巨噬細胞中HECTD1蛋白增高。
圖9矽肺患者HECTD1蛋白增高（摘自(Zhou et al., 2018)）
circHECTD1在矽肺中的作用模型
綜合本文的實驗數據和結果，本文作者發現ZC3H12A可結合併穩定circHECTD1分子，在二氧化硅的刺激下，細胞中circHECTD1的表達顯著下降，該下調作用使得HECTD1得以保留和增高，介導了ZC3H12A的泛素化降解作用，導致了巨噬細胞M1型活化狀態和肺纖維化等病理進程。
圖10 （摘自(Zhou et al., 2018)）
參考文獻：Zhou, Z., Jiang, R., Yang, X., Guo, H., Fang, S., Zhang, Y., Cheng, Y., Wang, J., Yao, H., and Chao, J. (2018). circRNA Mediates Silica-Induced Macrophage Activation Via HECTD1/ZC3H12A-Dependent Ubiquitination. Theranostics 8, 575-592.
解讀：circRNA微信公眾號|吉賽生物
circHECTD1參與矽肺的病理機制環狀RNA社區--CircRNA Community | 環狀RNA社區--CircRNA Community
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