【實驗工具】不能錯過的「CRISPR-Cas9」活動

02-12

本文首發於「解螺旋」微信公眾號

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　　平時，大家總覺得老談走技術流，酸菜走人脈流，今天，我必須顛覆這一成見，告訴各位小主，酸菜君玩起技術來，那也是相當兇殘的。

　　記得前幾日解螺旋推送過一篇介紹CRISPR/Cas9的文章，CRISPR/Cas9技術是近兩年新湧現的一種基因組編輯工具，能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯，為構建更高效的基因定點修飾技術提供了全新的平台，由於其易操作性和極強的擴展性，迅速成為了科研領域的新寵。

　　據傳說，CRISPR/Cas9系統可以幾乎靶向任意基因，且不受物種的局限。在這套系統中，gRNA通過鹼基互補配對實現對目的基因的識別，引導Cas9對DNA分子進行切割。可以預見，在今年的國自然申請中，運用CRISPR/Cas9來做基因操作無遺是件十分炫酷的事情，那麼科研之友酸菜同學怎麼能袖手旁觀？

　　同志們，要想玩轉CRISPR/Cas9系統，你首先得有Cas9蛋白的表達載體，然後你得有Cas9的穩轉細胞株。有了這種細胞，你只需要設計gRNA就可以做基因操作了，是不是很牛X，令人流口水？你們應該流口水，因為酸菜現在要給大家提供這種珍貴的細胞株。

　　在哺乳動物細胞中，要使CRISPR/Cas9系統工作就需要將Cas9和gRNA質粒共轉染進入細胞。一般gRNA質粒用U6啟動子表達，載體嬌小可人。然而Cas9質粒卻有個魁梧身板，基因本身有4kb之大，加上其他的序列，這個質粒通常大於9kb。都說質粒越大越難轉染，所以Cas9質粒轉染是這項技術在哺乳動物應用中的一個瓶頸。

　　解決這一技術難題的辦法之一便是利用慢病毒載體來表達Cas9，但這種方式也存在同樣的難點，就是單拷貝的慢病毒表達大片段基因時丰度不高，過表達的效果往往不夠理想。

　　前陣子，在實驗室技術大拿刀王的私房策略指導下，我們構建了用CAG啟動子表達Cas9蛋白的載體，這種載體比使用CMV啟動子的常規載體表達丰度更高，且CAG啟動子幾乎在所有細胞中都具有高強度表達的驚艷表現。細胞實驗中，酸菜的小夥伴用構建好的Cas9新載體（上面帶有HygroR，潮黴素抗性基因）轉染細胞，轉染後2天加入適量潮黴素，經過15天至30天的篩選，獲得穩定轉染的細胞克隆，經過鑒定的Cas9改造細胞系被用於後續研究中。

　　我們將增強型綠色熒光蛋白eGFP基因和針對eGFP設計的gRNA進行共轉染，驗證了酸菜版的CRISPR/Cas9具有良好的沉默效率，有圖有真相，look。

BGC-823-WX155:Cas9穩定株;

WG0001和WG0003:EGFP的兩個gRNA靶點;

WG0250:敲除另一個基因的靶點;

將eGFP載體、gRNA載體共轉染進入細胞，結果表明：eGFP的gRNA聯合Cas9可以很好敲除eGFP

　　那麼就有朋友要問了，這麼牛逼的細胞株我上哪裡能買到啊？作為一個苦逼科研十餘載的實驗狗來說，我真的只能說，你們太幸運了！各位解螺旋的小主，你們的運氣真的是好，因為這種細胞株，無論從名字、形態、功能、屬性，都完全超越了我們對一般實驗材料的認識，它所散發的特效，只能用「一旦擁有，別無所求」來形容，絕對是你研究生涯中不容錯過的典藏。

　　Cas9穩轉細胞株的特效，實在是太過於強大，它省去了你篩選細胞克隆的時間，大家想想，動輒數月，幾百盤細胞那是什麼樣的工作量！即使是你照著文獻和protocol做，沒有的酸菜的人品、老談的手法也是絕難成功的。你們知道就是這麼一小步你們已然跟學術前沿零距離接軌了，跟學術大牛們呼吸同一層空氣了。