炎症+自噬，兩個表型的交叉研究套路

02-12

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今天來講講一篇炎症和免疫的文獻。這是2016年eLife上的一篇文章，eLife差不多7-8分的水平。文章能發到ELife上是因為這是篇做轉基因動物的文章。

從文章題目看有這麼幾個關鍵詞：自噬、自噬相關的基因Atg16l1、T細胞亞群、腸道炎症。其中，自噬是2016年諾貝爾生理學醫學獎的獲獎對象，已經熱了好多年了。自噬，顧名思義就是自己吃自己，在自噬過程中細胞從內質網脫落膜去包裹細胞質、蛋白或者細胞器，形成自噬小體，與溶酶體融合形成自噬溶酶體，然後就能降解包含的內容物。

自噬的平衡非常重要，過多和過少都會影響細胞的存活。本文將自噬中的一個基因放到了炎症中去研究，這種做法在基礎科研中也是有套路的，下面會具體分析。

背景知識

本文展示了自噬的整個過程，包括啟動信號，形成預吞噬的自噬泡，形成自噬體，上圖展示了一些自噬的激活信號（藍色）和抑制信號（橙色）。

再來交代下免疫和炎症，這裡主要是腫瘤免疫。研究免疫要區分研究固有免疫還是適應性免疫，適應性免疫就是T細胞免疫等特異性免疫，而固有免疫就是非特異性免疫，兩者主要區別在於需不需要特異性的抗原刺激。

如果是研究固有免疫的，研究對象可以是DC細胞、NK細胞、巨噬細胞等等；如果是研究適應性免疫，那就要繼續細分是研究細胞免疫還是體液免疫，細胞免疫主要是T細胞介導，而體液免疫是B細胞來進行。這篇文章的內容著重於T細胞免疫。

T細胞有很多細胞亞群，比如左邊那些，這篇文章重點在Th2和Treg上面。

一旦談到免疫和炎症，要怎麼和臨床上的疾病結合起來呢？有4個相關度比較高的疾病，感染性疾病、自身免疫性疾病、慢性炎症和腫瘤（炎癌轉化）。又有哪些因素可以引起免疫反應？目前研究比較多的機制有熱休克反應、氧化應激、不正常蛋白摺疊、DNA損傷等等。不過本文從另一個角度把自噬和炎症聯繫在了一起。

結果概覽

先來看看摘要，以快速理解文章結構。

首先交代背景，之前已經有研究發現自噬相關基因Atg16l1的SNP位點和炎性腸病有關，但具體是什麼機制，目前還不清楚，順便提出問題。然後提出結果，回答問題，一般會用3-4句話。最後再總結下意義，拔高自己，說明研究意義。

然後再看看文章的結果。作者用了8張圖，可以分成4個部分。

Fig1闡述現象，小鼠T細胞選擇性敲除自噬相關基因Atg16l1導致自發性腸道炎症；
Fig2-3驗證Atg16l1的功能；
Fig4-5解釋細胞機制，Atg16l1對腸粘膜Treg的存活有顯著影響；
Fig6-7中換了個轉基因動物模型，在Treg中敲除目的基因，進一步證明了基因對Treg的影響；
Fig8中做了個簡單的分子機制。

Fig1 T細胞選擇性敲除Atg16l1導致動物自發性腸道炎症疾病

首先驗證模型，通過流式檢測發現，敲除了Atg16l1後小鼠CD4+T細胞自噬體形成受到阻礙。

Fig1B做了個自噬的Marker，LC3 II，其積累代表了自噬程度的增加，說明模型是成功的。

Fig1C中做了小鼠的體重曲線，顯示五月齡後體重進入平台期（發病），因為炎性腸病會影響消化。Fig1D、E顯示Atg16l1敲除的小鼠表現為脾臟和淋巴腫大。

接下來用免疫組化的方式檢測了炎性腸病的病理特徵，主要有4個方面：

a.小腸長度增加；

b.隱窩深度增加；

c.腸絨毛變短；

d.腸上皮細胞增生。

這就是炎性腸病的套路，如果要看建模後有沒有炎性腸病的特徵，就要看看體重，脾臟和淋巴結的大小，以及病理特徵。

Fig2 說明癥狀產生的原因

Fig2A首先檢測了模型中CD4+T細胞，主要檢測了4個組織，脾臟、腸系膜淋巴結、結腸固有層淋巴細胞、小腸固有層淋巴細胞，發現是顯著減少的。而Fig2B、C中說明的是同一個問題，輔助性T細胞亞群的變化情況，Fig2B是比例，Fig2C是絕對數量。由此找到輔助性T細胞亞群的主要變化是Th2。

Fig2D圖是個流式細胞結果，Fig2E是它的統計結果，重點是這個。

這裡用了兩個特異性Marker，Th2的Gata3和Th17的IL-17A，發現轉基因老鼠中，Th2細胞顯著增加，而且主要增加在結腸固有層里。

同樣的方法，在Fig2F、G中研究了Treg細胞，發現轉基因小鼠中，Foxp3+ Treg細胞顯著減少。

Fig3 補充體液免疫的變化

Fig3A中，敲除了Atg16l1後，小鼠血清免疫球蛋白IgE表達顯著上調（ELISA法），Fig3B中，給出了小鼠血清免疫球蛋白IgG各亞型、IgA、IgM變化情況。在Fig3C中給出了小腸派伊爾結（Peyre』s Patch）的HE染色圖片，主要有B細胞和T細胞。

作者在Fig3D、E、F中嘗試給予外源的抗原刺激，包括抗軟磷脂抗體（Fig3D）。Fig3E中，小鼠餵食雞卵清白蛋白或加霍亂毒素處置後IgE顯著增高。Fig3F小鼠用來源於菌群的鞭毛蛋白抗原刺激，IgG1和IgA顯著增高。

總而言之，Fig3是個補充結果，只是給出了細胞免疫對於體液免疫的影響。

Fig4 敲除Atg16l1對小鼠腸固有層Treg細胞存活有顯著影響

Fig4A-C中，作者從Atg16l1ΔCD4 和對照小鼠中分離na?ve CD4+ T細胞進行誘導分化，發現，是否敲除Atg16l1對細胞分化後形成的Th2和Treg都沒有影響。說明敲除Atg16l1對Th2和Treg的影響不是通過分化。

Fig4D中，用IL-4，IL-13刺激Atg16l1ΔCD4 和對照小鼠中分離Foxp3+ Treg細胞，無顯著差異。這是考慮Th2細胞分泌的因子可以負調節Treg，進行排除。

在Fig4E、F中，基因敲除小鼠和對照小鼠中分離na?ve CD4+ T細胞進行長期誘導， Th2明顯升高，Treg顯著減少。接下來補充凋亡檢測。

Treg凋亡率顯著增加， Th2影響不顯著

這篇文章到這並沒有進一步解釋Th2細胞怎麼上升的，接下來把所有的問題聚焦到了Treg。

Fig5 Atg16l1小鼠移植野生型pTreg細胞無法逆轉Th2變化

Fig5A中作者選擇幼年的基因敲除小鼠過繼性輸入pTreg細胞後脾臟，腸系膜淋巴結和結腸固有層淋巴細胞的CD4+T細胞中CD45.1+與CD45.2+細胞比例分布，cLP中CD45.1+有生存優勢，其中pTreg——外周調節性T細胞，主要位於腸道粘膜，可抑制Th2細胞免疫反應。

Fig5B中過繼性輸入pTreg細胞脾臟，腸系膜淋巴結和結腸固有層淋巴細胞的Foxp3+Treg細胞中CD45.1+與CD45.2+細胞比例分布。

由此作者得出結論：成功在Atg16l1ΔCD4回復Treg細胞

那回復後對Th2有沒有影響呢？

Fig5C-E的結果說明，小鼠過繼性輸入pTreg細胞後結腸固有層淋巴細胞中Th2、Th1和Th17 細胞比例，CD45.2的Th2比例較高，Th1比例較低，源於cLP中Th2的激活。

Fig5F-H中小鼠過繼性輸入WT pTreg細胞不能逆轉腸道炎性病理反應，IgE依然顯著增高，推測Th2細胞上升並非受到Treg影響，是內源性作用。可以看到，這些就是前面做過的實驗……全是套路啊。

Fig6在Treg中敲除Atg16l1與Th2中敲除的表型一致

從Fig6開始，作者其實做的東西和前面一樣，就是換了個Treg小鼠模型。在野生型老鼠中，Foxp3+ Treg細胞的自噬水平顯著高於Foxp3-CD4+ T 細胞，提示Treg對自噬有依賴。

接下來Fig6C-F都是前面做過的實驗，很簡單。敲除了Atg16l1基因的小鼠，在五個月後發生嚴重炎症性疾病癥狀，包括體重減輕，脾臟和淋巴腫大，小腸長度增加，以及多組織的白細胞侵潤。

Fig7 看了小腸和結腸中的炎性情況

Fig7A做了小腸和結腸的CD3染色熒光圖片，CD3 (red)、b-catenin (green)、 DAPI (blue)。而在Fig7B、C中檢測了結腸固有層淋巴細胞中CD4+TCRβ+ T細胞比例和數量，這個前面也做過。

接下來的這些圖，前面也見過，不過作者為了簡化數據，有些前面選了4個組織，這次就做了腸系膜淋巴結和結腸固有層淋巴細胞，看一下效應性T細胞的比例，Th1、Th2、Th17細胞比例和數量，脾臟、腸系膜淋巴結和結腸固有層淋巴細胞中Gata3 CD4+ T細胞比例，以及血清中免疫球蛋白IgE含量。都是重複的方法。