骨科外泌體研究套路：破骨細胞對成骨細胞的影響

02-12

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今天分享的是Cell Discovery上的骨科文章，講述了破骨細胞外泌體中miRNA對於成骨細胞的影響。首先來看下今天的文章題目：

其中有四個關鍵字：成骨細胞、破骨細胞、外泌體、miRNA，四部分連起來這篇文章也就是研究源自破骨細胞的外泌體中miRNA能夠抑製成骨細胞的活性，來看看具體是怎麼做的。

一、實驗假說

科學研究第一步就是提出假說，然後再開始證明，這也是核心的科學思想。本文的假說如下圖所示：

這裡面有三個核心內容，支撐起這篇文章：

1、從破骨細胞來源外泌體能夠被成骨細胞攝取並影響其成骨功能——闡釋模型

2、進一步研究發現，在破骨細胞外泌體高表達miR-214，能夠負調節ATF4，抑製成骨效應——提出分子

3、破骨細胞外泌體依賴於ephrinA2- EphA2信號途徑影響下游效應——解釋機制

研究的邏輯鏈就是：

二、結果解讀

本文用七張大圖來呈現研究的數據，可以分為四部分：

1、Fig1交代了分子的來源，並進行了對miRNA的篩選，選擇了此次研究的對象miR-214；

2、Fig2-Fig4是通過了離體實驗驗證了外泌體以及ephrinA2- EphA2信號的生物學功能；

3、Fig5-Fig7是在動物模型中對外泌體miR-214做了功能鑒定，尤其是Fig7是對於治療策略進一步深入的研究。

Fig1作者是要鑒定破骨細胞來源外泌體及miRNA，那首先就要做一個破骨細胞的模型。作者選了經典的小鼠RAW264.7做為前體細胞，之後加入RANKL（NF-κB受體活化因子配體）誘導2天，基本骨科做破骨細胞模型的都是這麼做的。

對於外泌體的觀察，作者除了用常見的電鏡技術外，還用了動態光散射技術（DLS）來檢測培養上清中顆粒粒徑分布。兩者都證明了有外泌體的存在。電鏡圖基本也是外泌體文章的標配。

當然，光看形態還不夠，接下來還用Western做了外泌體表達的Marker蛋白鑒定，有一些Marker是非常特異的，只在外泌體中表達。這篇文章選了HSP70、TSG101、CD63（熒游標記），除此以外為了證明是外泌體，還檢測了核蛋白標記，因為外泌體是沒有細胞核的（可以看到Western上的空缺），這裡選擇了TFIIB、LaminA/C。

確定了是外泌體後，作者開始對其中的內容物進行了分析，這裡用了Bioanalyzer進行片段長度的分析，在18-24 nt 處發現了豐堵富集。

接下來開始了文章的重頭戲，通過高通量測序篩選比較RAW264.7和RANKL誘導的RAW264.7的外泌體miRNA，並通過查文獻得知13個差異表達miRNA與骨代謝相關， qPCR驗證得到9個上調的和4個下調的miRNA。

作者選擇了miR-214-3p做研究對象，是一個顯著表達上調的miRNA。之所以選這個miRNA，因為作者在文獻中發現了這個miRNA能靶向ATF4來抑製成骨功能。這是一種略為保守的研究方案，降低了本文的學術創新，如果選一條全新的miRNA並找出靶向基因介導成骨細胞，那這篇文章的影響因子還能再高。

然後作者還非常嚴謹通過RNase降解實驗驗證了miR-214是來自於外泌體而不是凋亡小體和微泡的。這時候作者還不放心，又做了人的細胞模型，CD14+的人外周血單核細胞分選後加入macrophage colony- stimulating factor (M-CSF) 和 RANKL誘導，又做了一遍了形態學和Western檢驗，證實了誘導成功，當然也沒放過miR-214。這就是套路，告訴了我們最完整的外泌體miRNA檢測要做哪些。

Fig2開始做功能，先開始做外泌體被受體細胞攝入的觀察，在細胞模型MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨細胞前體細胞）中用DiO（細胞膜綠色熒光探針）標記了外泌體，Hoechst（細胞核染料）標記MC3T3-E1細胞。在共聚焦顯微鏡下就能觀察到破骨細胞來源外泌體被MC3T3-E1細胞攝入情況。同理用FAM標記了miR-214，觀察到了外泌體中miR-214被MC3T3-E1細胞攝入情況。

然後在人成骨細胞系hFOB1.19通過PCR對miR-214的作用進行了驗證。在文獻中已經揭示了在miR-214的下游是ATF4，接下來就是一整套實驗，先檢測了hFOB1.19細胞ATF4有沒有受到miR-214抑制，下游成骨細胞的相關標誌物包括Alp、Bglap、Col1a1有沒有受到miR-214的影響。

ALP染色活性鑒定，顏色越深成骨活性越強

整個Fig2就是說明了，破骨細胞外泌體來源的miR-214對成骨細胞的影響。

Fig3阻斷了外泌體，來觀察對於成骨細胞調控的影響是不是會被抑制，用了兩種抑制策略：

1、中性神經鞘磷脂酶（neutral sphingomyelinase）抑製劑 GW4869

2、外泌體釋放關鍵基因Rab27a的siRNA

這樣用兩種或三種方法來說明同一個問題，能讓文章的邏輯性更強。

作者又做了一套Fig2的檢驗來說明抑制破骨細胞外泌體對成骨細胞活性的影響。

Fig4開始機制研究，由文獻知破骨細胞ephrinA2可作用於成骨細胞EphA2受體抑製成骨。Fig4a-4g沉默了ephrinA2，Fig4i-4n沉默了EphA2來觀察對成骨細胞活性的影響。這些結果表明ephrinA2 / EphA2相互作用是外泌體在破骨細胞和成骨細胞之間的穿梭所必需的。

Fig5開始在體研究，用破骨細胞特異性蛋白Acp5的啟動子構建miR-214 Knock in小鼠（OC-TG214）。作為一個模型的驗證，首先要檢測破骨細胞、成骨細胞、血清中遊離miR-214和循環外泌體中miR-214的表達。

在體實驗與離體實驗不同，可以檢測骨組織和成骨細胞中的Alp、Bglap、Col1a1表達，除此之外，還能進行形態觀察發現OC-TG214鼠腰椎組織中骨小梁數量減少，骨密度降低，這也可以作為潛在的觀測指標。

Fig6中作者換了人的標本，還用了OVX去卵巢小鼠模型。檢測發現骨質疏鬆病人血清外泌體中的miR-214表達顯著高於正常人，在模型中也是一樣的情況。

然後作者叒對那些關鍵蛋白進行了檢測，還是是前面那一套。骨質疏鬆病人和OVX模型小鼠的ephrinA2表達、Alp、Bglap、Col1a1表達。以及沉默EphA2受體後的ATF4、Alp、Bglap、Col1a1表達。

Fig7驗證了一旦阻斷了外泌體是否會對OVX動物模型產生治療和緩解的作用。

Fig7a：3月齡OVX手術後8月開始注射Rab27a的脂質體siRNA，每周2次維持4周，取樣檢測。之後的檢驗方式也和前面一樣，比較新的就是這裡做了顯微Ct嗎，顯示了骨體積分數、骨小梁數量、骨密度上升而結構模型指數降低，說明其對骨質疏鬆是有緩解作用的。

三、套路分析

這篇文章研究了破骨細胞對成骨細胞經由外泌體來交互通訊的機制，其核心就是miR-214。對miRNA的研究就可以分析出如下套路：

片段長短：Bioanalyzer

分子篩選：二代測序+qPCR

外泌體特性：Rnase+Triton

分子來源：miRNA前體檢測

對於破骨細胞研究的學習也可以從幾方面進行：

細胞模型： RANKL誘導RAW264.7細胞（鼠）、外周血單核細胞分選+誘導（人）

觀察指標： TRAP，形態學

動物模型： 轉基因、OVX

相應的成骨細胞研究也能從這些方面學：

細胞模型： MC3T3-E1 （鼠）、hFOB1.19 （人）

觀察指標： Alp、Bglap、Col1a1

動物模型： 轉基因、OVX

在外泌體的特性上的學習包括：

鑒定：動態光散射、電鏡

標記：HSP70、TSG101、CD63

攝取：DiO熒光探針

分布：AB、MV、Exosome

阻斷：GW4869、Rab27a siRNA

上述的套路就已經包含了這篇文章中的所有研究內容。那是不是只有這些值得研究呢？當然不是，比如這篇文章的主角是miRNA，完全可以改成lncRNA、circRNA以及蛋白。我們可以在其中篩選鑒定出新的分子，提出新的機制。