circGFRA1在三陰性乳腺癌中起ceRNA的作用

越來越多的證據表明環狀RNAs（circRNA）是在腫瘤發生中起重要作用。然而，circRNA在三陰性乳腺癌（TNBC）中的功能在很大程度上是未知的。作者使用circRNA微陣列來鑒定在TNBC細胞系中異常表達的circRNA。在TNBC細胞系和組織中通過定量實時PCR（qRTPCR）檢測顯著上調的circRNA的表達水平circGFRA1。採用Kaplan-Meier生存分析方法探討circGFRA1在臨床預後中的意義。然後通過細胞增殖，凋亡和小鼠異種移植試驗檢測了circGFRA1在TNBC中的功能。

此外，通過熒光素酶實驗驗證circGFRA1在TNBC中的miRNA海綿體功能。微陣列分析和qRT-PCR證實在TNBC中circGFRA1表達上調。 KaplanMeier生存分析顯示，circGFRA1表達上調與存活率較差相關。circGFRA1的敲低抑制TNBC的增殖並促進細胞凋亡。通過熒光素酶實驗檢測表明到circGFRA1直接GFRA1和miR-34a結合。隨後的實驗表明，circGFRA1和GFRA1通過對miR-34a的海綿吸附作用調節彼此的表達。得出結論：circGFRA1可能作為競爭性內源RNA（ceRNA）吸附miR-34a調節GFRA1的表達以發揮調節TNBC生長的功能。 circGFRA1可能是診斷TNBC治療的生物標誌物和潛在靶點。

1、circRNA GFRA1在TNBC中高度表達

為了研究TNBC中的潛在參與調控的circRNA，作者在三種TNBC細胞系（MDA-MB-231，MDA-MB-468和BT549）和一種HME細胞系（MCF-10A）上進行了高通量的circRNAs微陣列測定。篩選出10個上調的circRNA，並進行qRT-PCR以驗證前8個上調的circRNA的表達，其中hsa_circ_005239在TNBC細胞中上調的最顯著（下圖），其來源於GFRA1基因，於是將其命名為circGFRA1。

2、circGFRA1敲低後抑制TNBC細胞的生長

作者接下來使用RNA干擾敲低circGFRA1的表達來評估其在TNBC中的生物學功能。 qRT-PCR分析表明抑制是成功的(下圖A)，隨後檢測細胞增殖測定circGFRA1的下調會顯著抑制TNBC細胞的生長（下圖B），此外EdU檢測顯示在下調circGFRA1後，TNBC細胞的增殖潛力受損，在集落形成實驗中，circGFRA1下調後，TNBC細胞集落形成能力顯著降低（下圖C）。

3、 circGFRA1作為miR-34a的海綿吸附體

通過分別檢測細胞質和細胞核中的circGFRA1，結果顯示circGFRA1主要分布在TNBC細胞的胞質中（下圖A），它可能作為一個ceRNA來結合miRNA，導致相應的miRNA靶靶標轉錄物的釋放。

通過預測，在circGFRA1序列內發現miR-34a的潛在結合位點，因此作者進行螢光素酶報告基因檢測以確定miR-34a是否可以直接與circGFRA1結合。qRT-PCR分析表明轉染成功（下圖B），當circGFRA1螢光素酶報告質粒和miR-34a mimics共轉染時，熒光素酶強度降低超過40％，而當circGFRA1螢光素酶報告質粒和miR-34a 干擾共轉染時，熒光素酶活性顯著增強（下圖C）。

qRT-PCR檢測進一步證實miR-34a mimics可抑制circGFRA1的表達而miR-34a干擾會增加circGFRA1表達（下圖D），在circGFRA1敲低時miR-34a的表達會上調（下圖E）。數據證實circGFRA1在功能上與miR-34a相互作用，並作為miR-34a的海綿吸附體。

4、circGFRA1作為miR-34a的ceRNA調控GFRA1的表達

為了研究circGFRA1是否作為ceRNA吸附miR-34a並釋放GFRA1的表達，作者繼續檢測GFRA1在乳腺癌細胞系和組織中的表達，結果顯示GFRA1在TNBC細胞系中也上調（下圖A）。

此外，使用TargetScan來鑒定miR-34a的假定靶基因，並預測GFRA1，為了證實這一發現，作者構建了含有全長GFRA1 3′-UTR的螢光素酶報道基因載體，其含有miR-34a和突變型的靶位點，與miR-34a mimics轉染到MDA-MB-231細胞中。 當與miR-34a mimics共轉染時觀察到熒光素酶活性的顯著降低，當用突變體熒光素酶質粒共轉染時，熒光素酶活性沒有顯著差異。

相反，當與miR-34a inhibit共轉染時觀察到熒光素酶活性的顯著增加（下圖B）。qRT-PCR和WB驗證了GFRA1的表達被miR-34a抑制（下圖C），此外，miR-34a的表達被GFRA1抑制（圖5g）。這些結果表明GFRA1是miR-34a的直接靶標，circGFRA1可以作為miR-34a的海綿吸附體解除其對GFRA1表達的抑制作用。

RongfangHe,Peng Liu,Xiaoming Xie,et al. circGFRA1 and GFRA1 act as ceRNAs in triplenegative breast cancer by regulating miR-34a.J EXP CLIN CANC RES,2017,36:145

文：賽誠生物

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