重磅！Molecular Cell雜誌發表circRNA形成機制重要文章

11月22日，Molecular Cell雜誌在線發表了賓夕法尼亞大學佩雷爾曼醫學院Jeremy E. Wilusz教授為通訊作者的文章，介紹發現circRNA形成調控的新機制，楊力教授和陳玲玲教授為本文的共同作者。

研究circRNA的同行一定會注意到這個現象：同一個基因來源的linear RNA與circRNA的含量有時有相同的對應關係，有時卻恰恰相反。本文作者的初衷正是希望找出決定linear RNA與circRNA相對量的機制。基於RNAi篩選，作者利用果蠅細胞中構建的Mini基因報告系統，發現了剪切體組分及轉錄終止相關的基因被干擾之後能顯著增加circRNA的丰度，並進一步在體內和體外驗證了相關的現象[1]。本文的發現為circRNA形成的調控機制提供了非常有價值的信息。

那麼本文的作者是利用什麼實驗模型做的？怎麼發現這些與circRNA形成有關的基因的？具體的結論是什麼？本文的結論對circRNA形成機制的認識有什麼幫助？

篩選實驗用模型

作者在2015年就曾經報道果蠅中內含子反向互補序列，hnRNPs和SR蛋白在circRNA形成過程中的作用[2]。當時就用到了一種構建的Laccase2基因2號外顯子的mini基因報告系統。本文在原有的報告載體基礎上在上下游分別增加了外顯子1 和外顯子3。該報告載體用pMT啟動子，可以通過在培養體系中添加CuSO4誘導基因的轉錄。如果是常規的RNA剪切，會形成外顯子1,2,3依次連接的linear RNA產物，但由於外顯子2兩側存在反向互補序列，可單獨形成外顯子2來源的circRNA，此外，該報告載體的終產物中還有一小部分外顯子1和3直接連接的產物。作者通過Northern雜交的方法進行各種轉錄後產物的相對含量分析。

圖1 基於果蠅Laccase2的 mini基因報告系統 （來自[1]）

為方便研究，作者基於抗性標記（潮黴素抗性），在果蠅DL-1細胞中獲得了可誘導表達的Laccase2的 mini基因報告系統的穩定株。首先分析了該報告系統生成的linear RNA和circRNA的穩定性情況。CuSO4誘導後1小時，linear RNA產物就開始明顯增加，而circRNA生成的速度明顯慢很多。另一方面，為探明兩種形式的RNA分子的穩定性，作者還分析了它們的半衰期，首先脈衝誘導3小時，然後用BCS（bathocuproine disulphonate，一種RNA合成的抑製劑）處理，看兩種類型的RNA分子存在時間的長短。結果表明linear RNA半衰期較短，大約2小時左右，而circRNA半衰期甚至大於24小時。這些數據初步說明linear RNA和circRNA在生成速度，穩定性方面有非常大的差別，linear RNA的生成速度和降解速度都明顯快於circRNA。

圖2 linear RNA和circRNA生成速度與穩定性分析 （來自[1]，排列略有改動）

如何通過RNAi篩選出調控circRNA形成作用的因子的？

剪切體相關因子如何篩選到的？

有文獻報道果蠅中干擾SF3b1 (CG2807) 或 SF3a1 (CG16941)後，內源Laccase2基因的linear RNA產物會有所減少[3]。作者於是分析了干擾這兩個基因後兩種RNA的含量變化情況，circRNA居然增加了！那麼其它的SF3b和SF3a的亞基會是怎樣的情況？作者進一步分析了SF3b1~6及SF3a1~3的情況，全部都發現干擾後circRNA相對升高！但不同的亞基幹擾實驗中，linear RNA與circRNA的總量會有較大的波動，但兩者的相對變化趨勢是一致的，都是circRNA增多，linear RNA減少。

圖3 干擾SF3b和SF3a的亞基能顯著提高circRNA表達量 （來自[1]）

SF3b和SF3a的亞基對內源基因的影響如何？

上面是報告基因得到的結果，這一干擾過程對內源性的基因表達會是什麼影響呢？作者於是分析了果蠅細胞中內源Laccase2基因的linear RNA和circRNA的表達情況，QPCR和Northern實驗均表明，干擾上述的SF3b或SF3a的10種亞基均可顯著降低linear RNA的表達量，同時增加circRNA的表達量。

圖4干擾SF3b和SF3a的亞基能顯著提高內源Laccase2基因circRNA表達量 （來自[1]）

除了內源性Laccase2基因，在另外兩種內源基因Uex和Plex基因上也發現了相同的變化趨勢，說明這種變化不是報告基因載體或Laccase2基因特異性的現象。

圖5干擾SF3b和SF3a的亞基能顯著提高內源基因circRNA表達量 （來自[1]）

Plad B是一種已知的可結合併抑制SF3b的化合物，具有抗腫瘤活性。作者用Plad B處理後發現同樣會導致linear RNA下降，circRNA上升。這些實驗數據表明干擾或抑制U2 RNP的組分，能明顯降低linear RNA的生成，但可促進circRNA的生成，說明linear RNA形成過程對抑制U2 RNP的處理更敏感。

圖6 SF3b抑製劑降低linear RNA表達但增加circRNA的表達 （來自[1]）

其他剪切體的亞基是否也有類似的作用？

上面探討的幾個亞基都屬於U2 RNP的組分，剪切體是一個龐大的動態複合物結構，其它的剪切體組分是否也有類似的現象？作者於是針對剪切體的各種組分展開了探索分析，選擇了內源性Plex基因，原因是這個基因在上面的實驗中變化趨勢最明顯。共分析了35種亞基的情況，結果表明有25種亞基幹擾後circRNA的相對含量上升超過兩倍，很多的亞基甚至超過了10倍的變化，這些變化極顯著的組分包括：snRNPU1-70K、snRNP-U1-C、Prp8、Slu7和CG6015（CDC40）。這表明剪切體的很多核心組分的含量改變後能顯著提高circRNA的生成，抑制linear RNA的生成。除了Plex基因，作者也探索了這些剪切體組分對其他內源基因的影響，包括Laccase2，Uex，minibrain (mnb)，CG42663，Ect4。

圖7 部分剪切體亞基幹擾後顯著增加circRNA生成 （來自[1]）

轉錄終止相關因子是如何篩選到的？

本文作者除了剪切體，還探索了轉錄終止相關的因子對linear RNA和circRNA相對含量影響的情況。因為很多的研究表明circRNA的形成往往是聚合酶II轉錄完成後進行的，因此作者就設想，轉錄終止作用會不會與circRNA的形成有關係？於是作者首先針對轉錄終止過程中的內切核酸酶Cpsf73開始分析。結果發現干擾Cpsf73後，circRNA的表達升高了2倍左右。但奇怪的是即使將mini報告基因載體中的SV40 polyA元件替換成能自動切割的鎚頭狀核酶元件HhRz，干擾Cpsf73後依然會提高circRNA的含量。更奇怪的是，即使不加誘導劑的情況下，干擾Cpsf73依然會提高circRNA的含量！

圖8 轉錄終止因子參與circRNA形成過程（來自[1]）

為什麼會出現不加誘導劑也能表達報告基因？

這不太可能是簡單的滲漏表達，因為空白對照組是沒有表達的。一定存在另一個可以啟動mini報告基因表達的啟動子，作者於是將mini報告基因替換成另一個基因，dati，該基因可以不藉助內含子的反向互補序列而形成circRNA產物。置換後同樣會發現dati基因在不加誘導劑的情況下干擾Cpsf73後也可以表達。在這個載體的上游有一個LTR啟動子，用於表達抗性基因HygroR，會不會是這個啟動子後面不終止了，導致通讀，然後轉錄出了mini報告基因的產物？作者經過進一步的實驗表明確實是這樣的情況。在Northern雜交的結果中也能看到通讀造成的融合形式的轉錄產物。

圖9 干擾Cpsf73後出現轉錄通讀 （來自[1]）

轉錄通讀作用如何證明的？

與直接啟動mini報告基因啟動子的情況有些不一樣，這種通讀作用產生的mini報告基因產物中circRNA形式的產物明顯更多。轉錄終止作用的模型中，Cpsf73作用之後會引入Rat1外切酶（5』→ 3』）的作用位點，Rat1將後面的RNA降解掉，形成完整的轉錄產物，實現轉錄終止。干擾Rat1後，linear RNA形式的融合產物變少。干擾另一種轉錄終止相關的因子Symp，也有與Cpsf73類似的情況。為進一步證實轉錄通讀的現象，作者將mini報告基因進行了改造，Laccase2基因置換成eGFP，轉錄終止元件置換成HhRz，為保護轉錄產物不被進一步降解，HhRz前面增加了NSs元件。結果證明轉錄通讀的情況確實會在干擾Cpsf73後產生。

圖10干擾轉錄終止因子促進下游circRNA形成 （來自[1]）

轉錄通讀作用在人類的細胞是否也會影響circRNA的形成？

在人的PA1細胞中用DRB處理，然後脈衝標記4sU，以準確的鑒定新生RNA。基於共表達特徵分析，作者篩選出39種可能存在轉錄通讀的基因對。挑選了MATR3和 PAIP2作為研究對象進行分析，PAIP2位於下游，且與MATR3是同一個方向的基因。PAIP2有一種外顯子2和3形成的circRNA（circ PAIP2）。作者在這個模型中分別干擾了CPSF3(CPSF73)和CPSF4 (CPSF30)，表明可明顯增加兩種基因中間的銜接區的RNA產量，說明存在轉錄通讀的情況。與此同時，circPAIP2的含量也隨之升高，說明人類細胞中也存在與果蠅模型中類似的轉錄通讀作用及下游基因circRNA表達增高的現象。進一步，利用翻譯核苷酸（ASO）對通讀產物進行干擾，有效率達80%，與此同時，下游的circPAIP2也隨之減少，說明這種條件下circPAIP2是由轉錄通讀造成的。

圖11 人類細胞中也存在轉錄通讀促進下游基因circRNA生成的情況 （來自[1]）

到此，本文的故事就結束了。本文為circRNA的形成作用提供了非常好的研究思路，也大大提高了我們對circRNA形成作用的理解和認識。

人類基因組中超過75%的區域能在轉錄組研究中發現，其中很大一部分是非編碼區的，這裡面有沒有類似轉錄通讀的作用導致的？與此對應的，circRNA的表達量是否也是基因之間類似轉錄通讀這樣的作用過程造成的？本文還提示linear RNA與circRNA的生成過程對剪切體的活性狀態敏感性有較大差別，circRNA似乎更「耐受」剪切體狀態不佳的情形，對應於疾病，應激，環境壓力等脅迫條件下，剪切體活性的一些細微改變是否能系統影響linear RNA和circRNA的表達平衡狀態？這篇文章雖然只是報道了兩個有趣的發現，在機制方面並未深入探索，但這些有趣的現象為探究circRNA形成機制及circRNA與linear RNA相互關係的問題打開了一扇窗戶。

1. Dongming Liang, D.C.T., Zheng Luo, Huang Wu, Li Yang, Ling-Ling Chen, Sara Cherry and Jeremy E. Wilusz, The Output of Protein-Coding Genes Shifts to Circular RNAs When the Pre-mRNA Processing Machinery Is Limiting. Molecular Cell, 2017.

2. Kramer, M.C., et al., Combinatorial control of Drosophila circular RNA expression by intronic repeats, hnRNPs, and SR proteins. Genes Dev, 2015. 29(20): p. 2168-82.

3. Wahl, M.C., C.L. Will, and R. Luhrmann, The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell, 2009. 136(4): p. 701-18.

文：circRNA公眾號|吉賽生物