具翻譯功能的 Circ-ZNF609及其在肌生成中的功能研究

02-12

Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis

circRNA以獨特的結構參與轉錄，但其功能仍有待研究。目前circRNA通過反剪接反應的生物合成方式已被廣泛認同，然而他們在生理相關過程的調節作用仍未闡明。本文研究circRNA在小鼠和人類成肌細胞的體外分化過程中的表達差異，發現高保守circRNA的表達水平受肌生成和杜氏營養及不良症（DMD）狀態的影響。採用高通量功能基因篩選來研究肌分化中circRNA的功能，發現Circ-ZNF609能特異性地調節成肌細胞的增殖。令人意外的是，與線性轉錄子一樣，Circ-ZNF609包含了一個從起始位點到終止位點的開放閱讀框架（ORF）。除此，Circ-ZNF609能與高密度多核糖體結合，且能以剪切依賴和帽子不依賴的方式翻譯蛋白。這為真核細胞circRNA能編碼蛋白提供了一個有利的證據。

環狀RNA是一種非編碼RNA，其通過反剪接產生，以共價鍵形成閉合環，不具有5』帽子和3』尾巴結構。它可以作為miRNA海綿調控靶基因的表達，也可以與多種蛋白結合發揮不同的生物學功能。儘管環狀RNA已在多種細胞組織中被研究，但其對生物代謝過程的調控作用仍有待研究。

目的

研究肌生成相關的circRNA及其在肌生成和肌肉疾病中的作用。

1、肌細胞內circRNA表達豐富，進化高保守

通過RNA-Seq篩選人源和小鼠（C2C12）成肌細胞（GM, myoblasts）分化為肌管細胞（DM, myotubes）過程以及杜氏肌營養不良癥狀態下差異表達的circRNA，並採用FindCirc軟體檢測circRNA(圖1A)。檢測到人和小鼠的GM和DM中均存在豐富的circRNA（圖1B）。對這些circRNA進行基因組區域（GO）注釋，發現近90%的circRNA源自編碼蛋白基因的外顯子區(圖1C)。此外，研究人員發現有相當一部分的circRNA（特別是高表達的circRNA）在人類和小鼠之間具有較高的保守性(圖1B, 1D)。

2、肌肉分化和疾病對circRNA表達的影響

本文研究circRNA表達差異，僅將來源於人類樣本、至少含有5個反剪接反應(back-splicing) reads的circRNA納入研究。圖2A表明GM和DM各自的兩個重複樣本間的circRNA具有非常好的相關性，說明兩個重複之間具有高度的一致性。從整體上觀察肌肉分化及疾病狀態下circRNA表達譜差異（圖2B），結果展現了兩種差異：第一，人源GM和DM之間circRNA的表達存在較大差異，說明肌分化能調節circRNA的表達；第二，相比正常人，肌營養不良症病人的GM與DM中均存在著大量異常表達的circRNA，說明疾病狀態也影響circRNA的表達（圖2B）。circRNA與linear RNA比率的結果已與上述結果一致（圖2C,2D）。進一步探究差異表達的circRNA與linear RNA的關係，發現circRNA和linear RNA之間的表達呈現正相關關係（圖2E）。此外，circRNA的丰度顯著高於無差異和下調組，即上調基因的差異比較顯著（圖2F）。

3、基於RNA干擾技術的circRNA功能篩選

根據circRNA的保守性、表達丰度、調控分化作用和環化率4個指標，研究在肌分化過程中具有重要作用的circRNA，篩選到31個候選circRNAs。在RT-PCR和RNase R抗性實驗確證後，研究人員對20個circRNAs進行了45個siRNAs干擾。進一步的溴脫氧尿苷（BrdU）標記實驗（圖4A）顯示，敲低circ-ZNF609明顯抑制了細胞的增殖（約80%），提示其在成肌細胞增殖過程中可能起著重要調控作用。隨後發現敲低circ-ZNF609亦能抑制增殖標誌物CDK1和cyclin A2的蛋白表達（圖4E）。此外，在DMD病人的成肌細胞中circ-ZNF609的表達明顯升高（圖4G）。以上結果表明，circ-ZNF609可通過調控細胞增殖影響肌生成。

4、Circ-ZNF609能編碼蛋白

深入研究後發現，Circ-ZNF609是由ZNF609基因的第二個外顯子開始環化形成。令人意想不到的是，Circ-ZNF609竟含有一個753-nt的開放閱讀框（ORF），其中包含轉錄起始位點和終止密碼子(圖5A)。另外，通過蔗糖梯度分離實驗發現Circ-ZNF609與高密度的多核糖體存在結合(圖5B)，這意味著circ-ZNF609可能編碼蛋白質。為確證circ-ZNF609是否具有編碼蛋白質的能力，研究人員對能特異性過表達Circ-ZNF609的p-circ載體進行結構改造，利用CRISPR/Cas9技術在p-circ基礎上添加3×Flag標籤，構建了p-circ 3xF載體(圖6A)。利用過表達和突變實驗，驗證了Circ-ZNF609的結構中關鍵位點（兩個起始位點）對於編碼蛋白的作用。此外，熱應激（2h 44℃）能使circ-ZNF609的翻譯能力增強（圖6F）。以上實驗表明，CircZNF609能翻譯蛋白，且該過程受熱應激誘導。

5、IRES激活Circ-ZNF609的UTR（非編碼區）

由於circRNA沒有帽子結構（cap），其翻譯需要一個IRES序列（內部核糖體進入位點）。為檢測Circ-ZNF609是否具有IRES活性，研究人員將其UTR插入雙順反子結構的螢火蟲和海腎螢光素酶之間，構建熒光報告酶基因(6G)。結果顯示，內源性Circ-ZNF609的UTR具有依賴於剪接方式的IRES活性(6H)，即Circ-ZNF609能在IRES的驅動下以剪切依賴的方式翻譯蛋白質。

經驗總結

該研究的初始目的是尋找肌生成特異相關的circRNA，通過前期的高通量篩選、利用siRNA技術進行的功能性篩選發現了具有翻譯功能的Circ-ZNF609，後期實驗則是對其翻譯功能的驗證和機制探索。該研究不僅找到多種與肌生成特異相關的circRNAs，更重要的是發現了能夠翻譯蛋白質的Circ-ZNF609。我們從中得到啟示：大的發現往往是在不經意時被挖掘的，但其前提是要不懈努力、不斷地研究探索。

Legnini I, Timoteo G D, Rossi F, et al. Circ-ZNF609 Is a Circular RNA that Can Be Translated and Functions in Myogenesis[J]. Molecular Cell, 2017, 66(1):22.

文：永諾生物

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