circRNA與蛋白相互作用進展綜述

　　9月26日，Theranostics雜誌在線發表了加拿大多倫多大學楊柏華教授為通訊作者的綜述文章，系統匯總了截至目前circRNA與蛋白相互作用的研究進展[1]。

　　環形RNA雖然在20多年前就已經被發現了，但真正受到學術界關注還是近幾年的事，伴隨著二代測序技術的興起而逐漸受到國內外的熱捧。目前circRNA研究更多的是其表達特徵與疾病或生理活動的相關性，具體的分子細胞生物學機制報道相對少很多。但隨著各種篩選鑒定工作的深入開展，所篩選到的circRNA分子的作用機制必然越來越受到重視。circRNA的功能機制模型，目前報道最多的是作為內源競爭性RNA（ceRNA）競爭性結合miRNA。但也有一些報道發現circRNA分子可直接與蛋白相互作用，在本文中，楊柏華教授專門針對circRNA與蛋白的相互作用進行了系統的匯總和剖析。下面我們就一起拜讀一下這篇文章吧：

　　作者首先大致回顧了circRNA的研究歷史和主要研究歷程，功能研究的主要進展，包括競爭性結合miRNA等，但總體而言，circRNA功能研究還非常有限，還有很多未解之謎。除了競爭性結合miRNA，circRNA功能模型方面還有一些有趣的報道，包括攜帶內含子的circRNA（EIciRNAs）促進母基因的轉錄，circ-RasGEF1B促進ICAM-1基因的mRNA穩定性，以及circRNA直接翻譯蛋白或多肽等。

目前已報道的circRNA-蛋白相互作用及其機制

目前已明確的circRNA與蛋白相互作用的報道數目還不是很多，作者在文章中進行了詳細的匯總分析，匯總成表格如下：

表1已報道的circRNA-蛋白相互作用

circRNA-蛋白相互作用研究技術

目前最常用的circRNA-蛋白相互作用研究技術主要是基於免疫沉澱分析的方法，包括RNA Pull-down、RIP等。楊教授在文章中也重點介紹了這兩個技術的關鍵注意事項，還介紹了RNase保護分析（RNase protection assay，RPA）和基於雜交的細胞共定位分析技術。

RNA Pull-down

利用生物素標記的DNA片段作為探針，在Co-IP體系中釣取目標circRNA分子，如果有相互作用蛋白，則可以一起被鏈霉親和素標記的磁珠一起捕獲下來，後續可經過Western Blot或者質譜鑒定分析相互作用蛋白。所用的探針必須是跨過環化位點的，建議長度為30-40nt。為減少線性RNA的干擾，作者建議增加RNase R消化處理。由於circRNA複雜而特殊的結構，實驗必須設計嚴謹的對照，建議同步進行過表達和敲低實驗，以有效排除非特異性的信號。

RIP

利用蛋白抗體進行Co-IP實驗，分離被捕獲的RNA分子進行後續鑒定分析。收取的細胞樣品在預冷PBS中洗滌，用Co-IP緩衝液進行裂解，加一抗孵育，用標記有Protein A的瓊脂糖凝膠珠進行IP實驗。所得到的產物分離RNA後測序或PCR分析。

RNase protection assay，RPA

RNase保護分析（RNase protection assay，RPA）是一種全新的研究RNA-蛋白相互作用的技術。如果一段DNA和RNA能夠互補配對，RNase H可以將RNA分子上沒有互補配對的部分水解掉，利用該活性，設計多條DNA探針靶向circRNA序列，如果circRNA與蛋白有相互作用，探針則無法準確結合，RNA分子就不會被RNase H降解掉。該方法可獲得circRNA與蛋白相互作用的準確序列信息，是非常有效的研究RNA-蛋白相互作用的工具。

熒光原位雜交（FISH）

原位雜交是研究核酸亞細胞定位的重要技術，基於熒光原位雜交（FISH）和蛋白免疫染色（IHC）的共定位分析，可以反映出circRNA與蛋白相互作用的情況。

circRNA-蛋白相互作用的生物學意義

circRNA-蛋白相互作用是揭開circRNA功能神秘面紗的重要技術，從已報道的相關研究可以看出這一相互作用過程也調控了彼此的功能。一方面circRNA與蛋白的相互作用呈現出動態的特徵，能夠實現對蛋白功能的調控，最典型的如circ-FOXO3，在不同的生理條件下能夠動態的與不同的蛋白相互作用，並調控了目標蛋白的功能（如下圖所示）。另一方面，蛋白與circRNA的相互作用也動態的調控了circRNA的形成作用等過程，典型的如QKI或MBL與circRNA的相互作用影響了circRNA的形成過程。

　　圖1 circ-FOXO3在不同生理條件下與不同的蛋白有動態相互作用過程（來自[1]）

參考文獻：

　　1. William W Du, C.Z., Weining Yang, Tianqiao Yong, Faryal Mehwish Awan, Burton B Yang, Identifying and CharacterizingcircRNA-Protein Interaction. Theranostics, 2017.

　　2. Hansen, T.B., et al., Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature, 2013. 495(7441): p. 384-388.

　　3. Ashwal-Fluss, R., et al., circRNA biogenesis competes with pre-mRNA splicing. Mol Cell, 2014. 56(1): p. 55-66.

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　　5. Du, W.W., et al., Foxo3 circular RNA promotes cardiac senescence by modulating multiple factors associated with stress and senescence responses. Eur Heart J, 2016.

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　　7. Du, W.W., et al., Foxo3 circular RNA retards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 and CDK2. Nucleic Acids Res, 2016. 44(6): p. 2846-58.

　　8. Du, W.W., et al., Induction of tumor apoptosis through a circular RNA enhancing Foxo3 activity. Cell Death Differ, 2016.

　　9. Yang, Q., et al., A circular RNA promotes tumorigenesis by inducing c-myc nuclear translocation. Cell Death Differ, 2017.

　　10. Zhen-Guo Yang, F.M.A., William W Du, Yan Zeng, Juanjuan Lyu, De Wu, Shaan Gupta, Weining Yang and Burton B Yang, The circular RNA circ-Amotl1 interacts with STAT3 increasing its nuclear translocation and wound repair by modulating Dnmt3a and miR-17 function. Molecular Therapy, 2017.

　　文：circRNA微信公眾號|吉賽生物

原文：circRNA與蛋白相互作用進展綜述