circBIRC6參與幹細胞多能性調控

10月27日，Nature Communications雜誌在線發表了台灣中央研究院Kuo Hung-Chih為通訊作者的文章，報道發現circBIRC6參與幹細胞多能性調控[1]。

文章報道發現幹細胞中特異的剪切因子ESRP1調控了circBIRC6的形成過程，circBIRC6通過競爭性結合miR-34a和miR-145參與調控幹細胞多能性。ESRP1受到Oct4，Nanog等轉錄因子的調控。本文首次報道幹細胞多能性相關的circRNA分子，是circRNA功能研究的重要擴展。那麼作者是怎樣確定circBIRC6與幹細胞多能性的關係的？如何確定ESRP1調控circBIRC6的形成過程的？帶著這些疑問，我們一起來拜讀一下這篇文章吧：

如何篩選幹細胞多能性相關circRNA 分子的？

作者篩選幹細胞多能性相關的circRNA總體思路是：基於Nikolaus Rajewsky教授2013年發表在Nature的文章的數據，從中找出Reads數大於40的circRNA分子（共61種），然後基於RNase R消化後PCR驗證，再分析hESC分化前後是否有特異性變化等，最終找到目標circRNA分子。

圖1 幹細胞多能性相關circRNA分子篩選方案流程（來自[1]）

hESC分化的實驗選擇了體外分化胚狀體（EB球）的體系，主要比較分化為EB球前後circRNA的表達變化，以及所對應的線性mRNA的變化情況。從資料庫中初步篩選得到的61種circRNA分子，有21種可在hESC細胞中鑒定到，與分化為EB球後相比，有11種為hESC特異性表達的，其中9種是在分化為EB球後明顯下調的。作者也在誘導多能幹細胞（iPSC）體系中進行了驗證，所有11種circRNA分子均在iPSC中富集。circRNA的表達經常會伴隨對應線性基因的表達而變化，經過比對分析，作者發現三種circRNA分子的表達不與所對應的mRNA表達變化一致：circBIRC6、circMAN1A2及circILKAP。進一步，作者通過Northern雜交分析了circRNA表達量與幹細胞多能性狀態的相關性，表明有三種circRNA的表達呈現出強相關性，它們是：circBIRC6、circCORO1C和circMAN1A2。

圖2 體外分化實驗分析多能性相關circRNA分子 （來自[1]）

以上的實驗說明了3種circRNA分子的表達狀態與細胞的多能性狀態的相關性，還不能說明這些circRNA分子參與了幹細胞多能性的調控，還需要針對這些circRNA分子進行Knock Down分析。於是作者設計了RNA干擾實驗進行分析，結果表明干擾circBIRC6和circCORO1C後AP染色陽性率明顯減少，而干擾circMAN1A2後作用並不明顯。QPCR和免疫熒光等實驗分別分析乾性及分化狀態相關的轉錄因子或marker基因都表明干擾circBIRC6和circCORO1C後幹細胞多能性狀態明顯受到影響，傾向於分化狀態。干擾circMAN1A2後作用不明顯。

圖3 circBIRC6和circCORO1C與幹細胞多能性相關 （來自[1]）

circRNA是由mRNA的前體分子加工形成的，會不會這種前體分子也參與了這一作用過程？作者分別設計了專門針對線性RNA分子以及共同外顯子區的shRNA分子，靶向相應外顯子區的可同時干擾線性RNA和circRNA，而專門靶向線性RNA區域的shRNA則不會影響circRNA的含量。AP染色結果表明單獨干擾BIRC6和CORO1C的線性RNA分子形式並不會影響細胞的多能性狀態。QPCR和免疫熒光等實驗分析多能性和分化相關的基因，結果表明是circRNA分子參與調控了細胞的多能性，多對應的線性mRNA並不會直接影響細胞的多能性狀態。

圖4 circRNA而非線性RNA參與幹細胞多能性調控 （來自[1]）

干擾circBIRC6和circCORO1C可影響幹細胞多能性狀態，那過表達它們能否穩定或促進細胞轉變為多能性的狀態呢？會不會促進體細胞重編程？在hESC中過表達它們並不影響細胞的多能性狀態。報告基因實驗表明單獨表達這些circRNA分子並不足以誘導細胞發生重編程。但在經典的四因子（Oct4、SOX2、Klf4和Myc，OSKM）誘導iPSC體系中，過表達circBIRC6和circCORO1C可明顯促進細胞重編程。

圖5 circBIRC6和circCORO1C可促進體細胞重編程效率 （來自[1]）

至此，作者基於初步篩選和嚴格的實驗論證，證明了circBIRC6和circCORO1C參與幹細胞多能性的調控過程，且過表達它們還可以促進體細胞重編程為iPSC。

circBIRC6和circCORO1C通過競爭性結合miRNA發揮作用

上面的工作詳細論證了circBIRC6和circCORO1C在幹細胞多能性調控過程中的作用，接下來需要解釋它們參與幹細胞多能性調控的分子機制。分子機制可以分為兩個部分：1.這些目標分子是如何發揮作用的？其下游影響的基因有哪些？2. 這些目標分子是如何產生的？上游調控基因是什麼？作者分別針對這兩方面進行了探索分析：

circBIRC6和circCORO1C在幹細胞中主要影響哪些基因？

競爭性結合miRNA是目前報道最多的circRNA分子機制，作者在本文中也分析了circBIRC6和circCORO1C可能會影響的下游miRNA分子。首先需要分析目標分子的亞細胞定位，結果表明circBIRC6和circCORO1C主要定位於細胞質中。RIP實驗表明circBIRC6可結合AGO2而circCORO1C以及其他的線性RNA分子不能結合它們。利用PITA演算法預測分析，結合已報到的與細胞多能性的相關性，作者鎖定了miR-34a和 miR-145兩個miRNA分子。利用3』-生物素標記miR-34a和 miR-145，RNA Pull-down實驗證明circBIRC6可以與miR-34a和 miR-145相互作用。熒光素酶報告基因實驗也驗證了這一作用，並進一步分析了相互作用的序列位點。表達量分析實驗表明隨著分化進行，circBIRC6逐漸下降，而miR-34a和 miR-145相應升高。

圖6 circBIRC6競爭性結合miR-34a和miR-145調控幹細胞多能性 （來自[1]）

circBIRC6 的形成受到ESRP1調控

RNA剪切因子是調控細胞特異性circRNA形成的重要因素，作者分析了hESC和iPSC中特異性的剪切因子，發現其中ESRP1、SNRPN和HNRNPA1在幹細胞中表達，其中ESRP1的表達最高。干擾ESRP1後，circBIRC6表達明顯下降，對應的線性的BIRC6表達會升高。ESRP1結合原件呈現GGT-rich的特徵，經過分析，在circBIRC6的上游和下游內含子中各發現了一個可能的ESRP1結合位點，還有一個位於circBIRC6的上游區域，作者通過RIP實驗證明將預測的circBIRC6上下游的兩個結合位點突變之後，ESRP1便無法結合到對應的RNA分子。在干擾ESRP1的細胞中表達circBIRC6的模擬基因，circBIRC6的表達量也明顯低於對照組。作者還選擇內源基因組中不存在ESRP1結合位點的外顯子人為構建兩側插入ESRP1結合位點的報告載體，看ESRP1是否可調控形成circRNA分子，結果表明ESRP1確實可以調控形成circRNA分子。

圖7 ESRP1調控circBIRC6的形成 （來自[1]）

ESRP1在hESC和iPSC中有表達，那麼這個基因又是受到什麼基因調控的呢？是否與經典的乾性相關轉錄因子有關？作者基於ENCODE ChIP-seq數據分析了ESRP1的啟動子區域，發現了該啟動子區存在Nanog和Oct4的結合位點，並且存在幹細胞特異性的H3K27Ac修飾。通過構建ESRP1啟動子區的熒光素酶報告基因，進一步驗證了所預測的調控方式。

圖8 Nanog和Oct4調控ESRP1的表達 （來自[1]）

本文首次專門針對幹細胞多能性調控相關的circRNA作用機制開展探索，證明了circBIRC6可直接參与多能性的調控，發現和證明其形成過程是受到幹細胞特異性的RNA剪切因子ESRP1的調控。本文的相關研究思路和結論拓寬了circRNA功能研究的領域，提高了對circRNA形成機制的理解，尤其是組織/細胞特異性表達的circRNA形成機制的理解，是非常有價值的一項工作，對於組織/細胞特異性circRNA的功能和機制研究均有非常高的參考價值。

參考文獻：1. Chun-Ying Yu, T.-C.L., Yi-Ying Wu, Chan-Hsien Yeh, Wei Chiang, Ching-Yu Chuang & Hung-Chih Kuo, The circular RNA circBIRC6 participates in the molecular circuitry controlling human pluripotency. Nature Communications, 2017.

文：circRNA微信公眾號|吉賽生物

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