經典案例解讀—胞外囊泡（EVs）如何誘導腫瘤惡病質？

導讀

　　腫瘤惡病質是一組癥狀和體征，包括營養不良、厭食、虛弱、組織消耗和器官功能障礙等，常見於晚期轉移的腫瘤，惡病質可在50%的腫瘤患者中出現，占惡性腫瘤患者死因的20%-40%，是腫瘤患者死亡的主要原因之一，然而，介導癌症肌肉消瘦的惡病質關鍵分子機制仍然不甚明確。最近發表於《Nature Communication》的最新研究成果顯示腫瘤細胞通過細胞外囊泡（EVs）釋放高水平的Hsp70和Hsp90分子，從而直接激活肌肉代謝，引起惡病質產生，阻斷腫瘤細胞釋放Hsp70和Hsp90相關EVs有望成為癌症惡病質的有效治療策略。該研究思路清晰並提供了大量的體內外實驗證據，是腫瘤微囊泡研究方面很好的範例，下面我們一起來了解下這篇文章的研究

　　成果。

　　期刊： Nature communications

　　影響因子：12.124

　　作者單位：美國德克薩斯大學

研究概要

　　1. 發現腫瘤惡病質誘導腫瘤細胞可持續釋放Hsp70和Hsp90蛋白的現象；

　　2. 發現胞外囊泡EVs是腫瘤細胞釋放Hsp70和Hsp90蛋白的載體；

　　3. 體內外實驗證明腫瘤細胞釋放EVs攜帶高表達的Hsp70/90是導致肌肉消瘦的關鍵步驟；

　　4. 證明EVs （Hsp70和Hsp90）可通過TLR4誘導肌肉消瘦並引起系統性炎症反應；

研究結果

一、腫瘤惡病質誘導腫瘤細胞可持續釋放Hsp70和Hsp90蛋白

　　首先，研究者篩選並分析了LCM（lewis肺癌細胞條件培養液）中的分解代謝成分，發現主要的分解代謝活動都集中在分子質量約為70-100kDa的片段。質譜分析揭示這些活性片段是高純度的Hsp70、Hsp90α和Hsp90β。然後檢測了不同惡病質誘導腫瘤細胞中的Hsp70和Hsp90水平，證實持續釋放高水平Hsp70和Hsp90是惡病質誘導細胞的一個共同特徵。體內實驗也表明惡病質小鼠模型中血清Hsp70和Hsp90升高。

　　持續釋放高水平Hsp70和Hsp90是惡病質誘導細胞的一個共同特徵，高水平的Hsp70和Hsp90可以促進肌萎縮過程。

二、高水平的Hsp70和Hsp90與EVs相關

　　HSP分子沒有信號肽序列，無法通過從內質網到高爾基體的傳統路徑介導蛋白分泌。不同細胞採用不同的非傳統機制釋放Hsp70和Hsp90，其中一種就是通過EVs在表面表達HSPs。研究者分離鑒定了LCM和LLC荷瘤小鼠血清中的EVs，並在EVs中檢測到Hsp70和Hsp90。在Hsp70和Hsp90表達水平高的腫瘤細胞和荷瘤小鼠血清中均可檢測到高水平的EVs，而採用去垢劑Brij98溶解EVs和血清後，Hsp70和Hsp90濃度成倍地顯著上高。這些結果表明高水平的Hsp70和Hsp90與EVs相關。

　　腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）可誘導C2C12細胞肌萎縮

三、腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）對誘發肌肉消瘦是必要的和足夠的。

　　以往的研究表明，LCM通過p38 MARPK通路來激活C/EBPβ上調atrogin1和UBR2。體外體內實驗中，抗體中和Hsp70和Hsp90均可阻礙LCM誘導的p38 MARPK激活，並消除對小鼠體重和肌肉等系列指標的影響，驗證了Hsp70和Hsp90在誘發肌肉消瘦中的關鍵作用。而使用重組Hsp70和Hsp90處理肌管後可重新誘導肌肉的分解代謝。

　　腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）對誘發肌肉消瘦是必要的和足夠的。

四、腫瘤細胞表達的Hsp70和Hsp90是誘發肌肉消瘦的關鍵。

　　LLC細胞中，採用siRNA敲低Hsp70和/或Hsp90，而這種缺陷型細胞的調整培養基失去了誘導肌管分解代謝的能力。穩定敲低Hsp70和Hsp90構建荷瘤小鼠後發現，小鼠血清Hsp70和Hsp90也不顯示升高，同時，Hsp70和Hsp90缺陷LLC腫瘤不會誘導肌肉分解代謝和肌肉消瘦。

　　siRNA敲低Hsp70和/或Hsp90後誘導肌管分解代謝的能力隨之缺失

五、腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）可導致肌肉消瘦。

　　自LCM分離獲取EVs並用來處理C2C12肌管，發現LLC釋放的EVs以劑量依賴的方式，通過上調UBR2和atrogin1引起分解代謝反應。通過CD9-免疫沉澱的EVs處理C2C12肌管進一步驗證了CD9陽性EVs在分解反應中起作用。相反地，敲低Rab27a和Rab27b（控制EVs釋放的不同步驟中的GTPase）破壞腫瘤細胞釋放EVs後發現，Rab27丟失會阻止EVs、Hsp70和Hsp90的釋放，而不影響腫瘤細胞中Hsp70/90和AChE的表達，導致肌管的分解反應。體內實驗也證明敲低Rab27a和Rab27b阻止了血清EV和Hsp70/Hsp90的非正常升高，而小鼠也免受肌肉分解代謝和肌肉消瘦。

　　腫瘤細胞釋放EVs攜帶高表達的Hsp70/90是導致肌肉消瘦的關鍵步驟

六、腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）可通過TLR4誘導肌肉消瘦

　　Hsp70和Hsp90被認為是DAMPs，通過激活免疫細胞上的TLR2和TLR4來驅動先天免疫反應。EV相關HSPs可以激活受體細胞上的HSP受體，而TLR2和TLR4也在骨骼肌肉細胞上表達，因此，研究者猜想Hsp70/90通過激活TLR2/4誘導肌肉代謝。

　　在C2C12肌管中敲低TLR2或TLR4發現肌管對重組Hsp70和Hsp90的分解反應需要TLR4而不是TLR2。細胞實驗發現分解反應的激活確實表現為TLR4依賴。此外，體內實驗證明TLR4在Hsp70和Hsp90誘導的肌肉代謝中至關重要，TLR4缺陷可以消除重組Hsp70和Hsp90誘導的小鼠肌肉消瘦。

　　TLR4是EVs釋放Hsp70/90誘導肌肉代謝的關鍵分子

七、腫瘤細胞釋放的EVs （Hsp70和Hsp90）可引發系統炎症

　　在LLC荷瘤小鼠發展為惡病質的不同時間點，檢測血清中的細胞因子包括TNFα、IL-6、IL-1β和EVs、Hsp70和Hsp90。TNFα在21天後發展為惡病質時升高，IL-6在14天後升高；而在EVs、Hsp70和Hsp90未升高的Rab27缺陷小鼠中，血清TNFα和IL-6也未見升高，表明血清Hsp70和Hsp90介導腫瘤宿主中炎症細胞因子的升高。至於PTHrP，之前曾有報導可能通過將白色脂肪組織轉化為棕色而又打肌肉消瘦，但在本文的惡病質模型中並未發現異常釋放。

　　小鼠血清來源的EVs（Hsp70和Hsp90）可介導炎症細胞因子的升高，引發系統炎症

結語

　　EVs是細胞釋放的膜囊泡，可以分為三類：微泡、凋亡小體和外泌體。外泌體一般為30-150nm，是三者中最小的一類，由腫瘤細胞大量釋放到調整培養基和體液中。本研究中檢測到的腫瘤釋放到調整培養基和血清中的EVs大小約為110nm、表達標誌物CD9/TSG101/AchE，這些特徵均與外泌體一致。作者為了遵循外囊泡國際協會的建議採用了「外囊泡」的說法。本研究中多次運用功能缺失性和獲得性實驗證實了，腫瘤細胞通過釋放細胞外Hsp70和Hsp90促進肌肉消瘦，引起惡病質。此外，Hsp70和Hsp90可能通過直接作用於受體或間接地增加循環炎症因子，在不同器官上發揮著腫瘤病理效應。這不僅有助於闡述Hsp70和Hsp90在腫瘤誘導肌肉消瘦中的作用，也有助於理解腫瘤是如何影響機體全身代謝的，為癌症惡病質的有效治療策略方面提供了理論基礎。

　　來源：circRNA微信公眾號|吉賽生物

　　原文：經典案例解讀—胞外囊泡（EVs）如何誘導腫瘤惡病質？