基因組編輯課程，2分48秒告訴你基因敲除怎麼做？

現在的基因組編輯工具本身並不能改變基因序列的排布。它們能做的只是在基因組序列上製造幾個缺口。而真正改變基因組序列，編輯基因組序列的是細胞本身。

而我們能做的，是最大限度地誘導細胞按照我們的意願完成基因組編輯。

那麼，到底是怎麼個誘導方式呢？

咱們從基因敲除說起~

上視頻~

不願意看視頻的同學也可以看後面的文本哦~

如果我們要進行基因敲除。

最簡單但也最放任自流的方式是，在我們需要敲除的基因片段上製造一個切口，讓細胞自行進行修補。這個過程中，細胞有可能在缺口上缺失幾個鹼基，插入幾個鹼基。如果缺失或插入的鹼基不是3的倍數，這個基因就有可能因為移碼突變而出現功能缺失，從而實現敲除。我們從這些經過處理的細胞中隨機挑選出一些，分別進行單個細胞的培養和擴增。這些由單個細胞擴增形成的細胞群落被稱作一個單克隆。用western、PCR等方法分析這些單克隆的基因表達情況，就可以找到那些目的基因被敲除的細胞群落，也就是我們需要構造的基因敲除單克隆細胞系。這些單克隆細胞系的目的基因功能被缺失掉了，但是編碼基因的序列仍然被留在基因組裡，只不過被破壞了，無法正常表達。

另外一個更可控的方式是我們在這個基因序列距離較遠的兩個位點上分別製造一個切口，兩個切口間的大片段極有可能因此被刪除。我們可以篩選出這些發生大片段刪除的單克隆。它們的目的基因幾乎可以從基因組中完全刪除。但是這種方法需要挑更多的單克隆進行驗證，因為兩個位點同時被切割的概率比單位點被切割的概率更低。

前面講的這兩種方法都需要隨機挑取單克隆進行驗證。這個有點靠運氣。

有一個辦法可以讓我們的單克隆挑選更有目的性，那就是給咱們被編輯細胞加標記。

比如gfp熒光蛋白？抗性基因等等，在它們的兩邊加上目的基因序列的同源臂做成標籤序列。把它們放進細胞的同時，也放進去一些基因組編輯工具，在目的序列上製造缺口，增加同源重組的概率，把這些標籤給整合進去目的基因序列里。而這樣的大片段插入可以同時破壞目的基因的表達，造成其功能缺失。這樣我們就可以通過抗性篩選，或者基於熒光表達的篩選等找到我們的基因敲除細胞，一舉兩得。

敲除講完了，敲入呢？定點突變呢？如何提高編輯效率呢？

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