熒光光譜儀技術與市場簡析（1）

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1.熒光光譜儀簡介

熒光光譜儀又稱熒光分光光度計，是一種檢測物質的定性、定量分析儀器。 其原理是根據熒光效應：激光照射原子，原子中電子吸收能量躍遷到第一激發單線態或第二激發單線態， 但這些激發態是不穩定的，當電子由第一激發單線態恢復到基態時，能量會以光的形式釋放 ，產生熒光，一般持續發光時間短於10^-8秒（同時產生的磷光持續時間大於10^-8秒）。 通過熒光光譜儀的檢測，可以獲得物質的激發光譜、發射光譜、量子產率、熒光強度、熒光壽命、斯托克斯位移、熒光偏振與去偏振特性，以及熒光的淬滅方面的信息。熒光光譜分析技術常應用於生物研究、製藥分析、化工分析、食品檢測、醫學檢驗、環境監測、礦物分析等。

熒光光譜儀主要是根據熒光光譜和激發光譜來判定物質的性質和量，具體如下：使激發光的波長和強度保持不變，而讓熒光物質所發生的熒光通過發射單色器照射於檢測器上,調節發射單色器至各種不同波長處,由檢測器測出相應的熒光強度，然後以熒光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標作圖，即為熒光光譜，又稱熒光發射光譜。讓不同波長的激發光激發熒光物質使之發生熒光，而讓熒光以固定的發射波長照射到檢測器上，然後以激發光波長為橫坐標，以熒光強度為縱坐標，所繪製的圖即為熒光激發光譜，又稱激發光譜。

2.熒光光譜儀分類

按熒光原理可分：原子熒光光譜儀、分子熒光光譜儀和X射線熒光光譜儀等。

• 原子熒光光譜儀是通過測量待測元素的原子蒸氣在輻射能激發下所產生的熒光發射強度,來測定待測元素含量的儀器。原子熒光激發光源一般為高強度空心陰極燈或無極放電燈一般原子熒光光度計用來對各類樣品中痕量的鉛、汞、砷、鍺、錫、硒、碲、鉍、銻、鋅、鎘的等無機元素定性和定量分析，通常用於環境監測，礦物鑒定等 。
• 分子熒光光譜儀是利用某些物質被紫外光或可見光照射後所產生的,並且能夠反映出該物質特性的熒光,對其進行定性和定量的分析。分子熒光激發光源一般為是氙燈或高壓汞燈。一般用來測定主要是含有共軛不飽和體系的化合物，如含有機分子的物質，通常用生物醫學研究，製藥，化工等領域。
• X射線熒光光譜儀的發射源是Rh靶X光管，有兩種基本類型：波長色散型（WD-XRF）和能量色散型（ED-XRF）。其主要用於金屬元素的測定，在環境科學、高純物質、礦物、水質監控、生物製品和醫學分析等方面有廣泛的應用。

通用熒光光譜儀根據波長範圍大致可分為3種：

• 基本型：在200-800 nm的紫外可見波段的穩態光譜儀。
• 擴展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見-近紅外穩態光譜儀。
• 綜合型：覆蓋上述兩個波段，同時可測瞬態光譜的光譜儀。

3.熒光光譜儀先進分析方法（關係到配套軟體）

• 同步熒光分析。它與常用熒光測定最大的區別是同時掃描激發和發射兩個單色器波長，由測得的熒光強度信號與對應的激發波長(或發射波長)構成光譜圖，即同步熒光光譜。步熒光分析具有光譜簡單，譜帶窄、解析度高、光譜重疊少等優點，可提高選擇性，減少散射光等的影響，非常適合多組分混合物的分析，在環境、藥物、臨床、化工等領域應用廣泛。
• 偏振熒光分析。熒光體的熒光偏振與熒光各向異性值的測定，能夠提供與熒光體在激發態壽命期間動力學相關的信息，因此熒光偏振技術被廣泛應用於研究分子間的作用，例如蛋白質與核酸、抗原與抗體、蛋白質與多肽的結合作用等。
• 三維熒光分析。普通熒光分析所得的光譜是二維譜圖，而描述熒光強度同時隨激發和發射波長變化的關係譜圖，就是三維熒光光譜。它可以提供比常規熒光光譜和同步熒光光譜更為完整的光譜信息，是很有價值的光譜指紋技術。三維熒光光譜可以作為光譜指紋技術在環境監測(溶解有機質的分布等)、臨床化學(根據癌細胞熒光代謝產物的檢測，區分癌與非癌細胞等)以及細菌鑒別等領域應用；也可用於光化學反應監測、多組分混合物的定性和定量分析等。
• 時間分辨熒光分析。由於不同分子的熒光壽命不同，可在激發與檢測之間延緩一段時間，使具有不同熒光壽命的物質得以分別檢測，即時間分辨熒光分析。採用激光光源可以獲得皮秒(ps)級的脈衝寬度，可用於測定大多數熒光物質的壽命，非常有助於生物大分子和基團作用的研究。該技術與熒光免疫分析結合形成了時間分辨熒光免疫分析法。
• 低溫熒光分析。通常熒光分析都在室溫下進行，熒光光譜為帶光譜，由於自然界有許多有機化合物，其化學結構頗為接近，它們的光譜往往相互重疊，難以鑒別表徵以及定量測定。隨著溫度的降低，介質黏度增大，熒光分子量子產率和熒光強度將增大。因此，在低溫以及特殊條件下，熒光物質就能給出更易識別的的尖銳熒光光譜(「準線性光譜」)。這就有可能對樣品中所含熒光體進行「指紋識別」，甚至有可能對混合物中某些特定組分進行定量測定。低溫熒光分析可用於多環芳烴及衍生物的鑒別與定量、DNA加合物的分析等。
• 單分子熒光檢測。單分子熒光分析是實現單分子檢測最靈敏的光分析技術。單分子熒光檢測的關鍵在於確保被照射的體積中只有一個分子與激光發生作用以及消除雜質熒光的背景干擾。單分子熒光檢測可提供單分子水平上生物分子反應的動力學信息，分子構象以及構象隨時間的變化，因此尤其在生命科學領域中具有廣闊的應用前景，為生命科學提供了新的研究手段。

4.分子熒光光譜儀的優劣勢

分子熒光光譜儀優勢

• 制樣簡單，試樣多數不需經過化學處理就可分析，且固體、液體試樣均可直接分析。
• 分析速度快。雖然測定用時與測定精密度有關，但一般都很短，2～5分鐘就可以測完樣品中的全部待測元素。
• 多元素同時檢出能力。可同時檢測一個樣品中的多種元素。一個樣品一經激發，樣品中各元素都各自發射出其特徵譜線，可以進行分別檢測而同時測定多種元素。
• 敏感度高，選擇性好。熒光分析的靈敏度要比吸收光譜測量高2-3個數量級。分光光度法通常在 10-7 級 ，而熒光的靈敏度達10-9。
• 非破壞分析。在測定中不會引起化學狀態的改變，也不會出現試樣飛散現象。同一試樣可反覆多次測量，結果重現性好。

分子熒光光譜儀劣勢

• 在經典分析中，影響譜線強度的因素較多，尤其是試樣組份帶來的光譜重疊等，所以對標準參比的組份要求較高。
• 難於作絕對定量分析,需要精確的標樣做比較。含量（濃度）較大時，準確度較差。
• 對樣品化合物有共軛性要求,應用不廣泛.

5.分子熒光光譜核心技術

• 光源：由於熒光樣品的熒光強度與激發光的強度成正比，因此，作為一種理想的激發光源應具備：足夠的強度、在所需光譜範圍內有連續的光譜、強度與波長無關(即光源的輸出是連續平滑等強度的輻射)、穩定的光強。常用的光源主要有氙燈，激光器等。
• 探測器： 熒光的強度通常比較弱，因此要求檢測器有較高的靈敏度。一般採用光電倍增管(PMT，如單光子技術，常見於高端)， CCD（中低端）和二級陣列管等（低端）。
• 分光系統（稜鏡/光柵）：熒光光譜儀中單色器一般為光柵或濾光片，需要兩個，一個用於選擇激發光波長(激發單色器)，一個用於分離選擇熒光發射波長(發射單色器)。
• 整體設計：如防止光電干擾光路和電路系統設計，模塊化可升級設計，樣品池開放性設計，配套軟體等

6.分子熒光光譜關鍵技術指標

• 熒光光譜儀的光譜解析度。光譜解析度是指把光譜特徵、譜帶分解成為分離成分的能力。高級的熒光光譜儀解析度可達0.5～1nm。
• 熒光光譜儀的頻譜範圍。高級的熒光光譜儀可覆蓋200nm～1500nm。
• 熒光光譜儀中的波長準確度和波長重複性。波長準確度，是指波長的實際測定值與理論值(真值)的差，高端儀器的波長準確度可達0.1nm。波長重複性與波長準確度一樣重要，是光譜儀可靠性的標誌，高端的儀器可達0.1nm。
• 熒光光譜儀中的信噪比(S/N)。 一般水的拉曼S/N測試方法是把體系的靈敏度(信號存在)和體系噪音(信號不存在)的數據同時獲取並進行比較，顯示了儀器的綜合性能。較好的拉曼S/N可達6000：1。

7. 影響分子光譜儀技術指標的關鍵因素

• 光源 ：熒光強度基本隨激發光強度增強而增強，因此，高能閃爍氙燈的使用大大提高了靈敏度。脈衝氙燈只在測量時閃爍，一方面延長了燈的壽命，另一方 面避免了連續光源長時間照射引起的光敏樣品的光降解和生物 樣品。
• 探測器：PMT光電倍增管信噪比大，每個通道只能讀取分立式譜，靈敏度高，疲勞恢復快。CCD面陣式檢測噪音低，信號同步測定，可以讀出一段光譜區域內的連續光譜CCD，但CCD在響應速度、溫度穩定性等方面卻不如PMT。一般以PMT為探測器的光譜儀價格高於CCD光譜儀，常見於以單光子技術為基礎的高端儀器。
• 分光系統 （稜鏡單色器/光柵單色器）,一般光柵單色器解析度較高。另外,分光系統的中的狹縫，是影響解析度和控制色散的關鍵因素。優秀的光譜儀如PE，激發狹縫為2.5nm，步進為0.1nm。但狹縫也需要和整個系統匹配，如果狹縫小到嚴重影響該光電響應的靈敏度，也就導致光子信號太弱而無法形成有效光譜。
• 樣品池, 熒光儀用的樣品池需用低熒光的材料製成，通常用玻璃和石英材料，形狀以方形和長方形為宜。
• 樣品本身，如化合物組合的複雜程度，共軛分子間元素和形態相似性等，還有溶液的PH值，溫度等。
• 非線性：熒光發射與吸收在一定區間內呈線性關係，如果樣本量太大或光路角度沒有最優等其他因素導致兩者關係超出線性範圍，就會對量性判定造成很大誤差。

下次更新分子熒光光譜儀市場容量和趨勢，請耐心等待。

參考資料

葉憲曾, 張新祥. 儀器分析教程[M]. 北京: 北京大學出版社, 2007.

許金鉤, 王尊本. 熒光分析法[M]. 北京: 科學出版社, 2006.

對熒光光譜儀的四點總結，搜狐科技頻道

HORIBA（JobinYvon，PTI） ，愛丁堡（Edinburgh），珀金埃爾默（PerkinElmer）等網站

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