從患者開始談基因檢測的整個流程

基因檢測的整個流程可分為哪幾個大的步驟？

概況性地了解一個事務的框架是很有必要的，因為這樣我們心裡會有「底」。不管別人怎麼分，我簡單粗暴地把它分為四個程序：1，檢測前諮詢部分；2，實驗室部分；3，信息分析部分；4，臨床解讀部分。五臟俱全的基因檢測公司應該包含以上所有的四個程序，除非存在部分業務外包的情況，例如有的公司只做臨床解讀部分。1）檢測前諮詢部分：不是所有的癌症患者都應該檢測，都值得檢測，檢測目的是為了明確是否可以使用靶向藥物，還是僅僅為了玩，選擇哪種產品更加適合，這些都是需要在這部分搞清楚。2）實驗部分：應該取多少組織樣本，測序過程中有哪些細節步驟，這可是個核心環節。3）信息分析：實驗部分做完以後所得到的是一大堆序列，不分析就是一堆垃圾，信息部要做的就是從這些垃圾中挑選黃金。4）臨床解讀：黃金挑選出來不拿去換成大米然後進肚，那也沒什麼用，基因檢測的結果有什麼意義，對臨床實踐又何指導，全在這裡了。

四個程序，每個程序又包含哪些小工序呢？

通過上面的介紹，我們可以大體了解基因檢測分為四個程序，也明白四個程序主要做什麼。可是，每一個程序又具體涉及哪些小程序呢？剖析程序的過程，就是知識差異化的過程。1，檢測前諮詢：患者預期、產品選擇；2，實驗部分：樣本獲取與運輸、DNA製備與文庫構建、質控與上機測序；3，信息分析部分：數據分析、報告初稿；4，臨床解讀部分：檢測報告、臨床實踐、報告解讀/人文關懷。總而言之，簡單來說，從明確患者的檢測目的開始（用藥指導，耐葯後尋找新的方案，僅檢測一個基因或多個基因突變狀態等），到選擇合適的產品，然後獲取規範的樣本（血液，組織，唾液等），然後合適的運輸方式到達實驗室，然後一些列的規範實驗室操作及數據分析，最後到科學的檢測報告與諮詢服務。這就是四個程序所包含的內容。每一個程序分為許多小工序，每一個小工序又有許多學問與講究。下面將會詳細介紹每一個小工序。

程序一：檢測前諮詢部分

1.1：患者預期。銷售經理、產品經理、主治醫生與患者需要充分溝通，明確該基因檢測的目的，知道檢測技術的局限性，做好患者的預期控制。

1.2：產品選擇。對於基因檢測產品來說，產品選擇幾乎等同於檢測基因的選擇。哪些基因需要強行檢測、哪些基因推薦檢測、哪些基因有一定的檢測價值，這些需要闡述清楚。最後，根據患者的經濟情況與病情，綜合選擇（這是理想狀況）。實際操作過程中，銷售經理往往會以經濟利益為導向。

1.3：臨床信息。患者的臨床信息對於基因檢測報告者有重要意義，信息掌握越全面報告越個性化，諮詢解讀也更有針對性。因此，完整詳實的臨床申請單需要提供。

程序二：實驗部分

2.1：樣本類型。需要明確一點，能夠運用無創的盡量用無創（唾液與血液），因為沒有一個患者希望無緣無故的在自己身上打洞。固體：手術樣本，穿刺樣本，石蠟包埋組織，石蠟切片組織；液體：全血，血清+血細胞，胸水，腹水，唾液。1）手術樣本：（腫瘤組織≥50mg，癌旁正常組織≥25mg，收到組織後立即用至少5倍體積的10%中性福爾馬林固定液固定），切片25張以上，厚度5 μm，腫瘤細胞佔比≥50%，壞死組織區域<10%，4-8℃且24h內送達實驗室。2）穿刺樣本：穿刺一針以上，腫瘤細胞佔比≥50%，壞死組織區域<10%，4-8℃且24h內送達實驗室。3）石蠟包埋組織：常溫保存運輸即可，最好是1年以內。4）石蠟切片組織：常溫保存運輸即可，最好是6周以內。5）全血：6ml-10ml for NGS (Streck管，含有保存液，負壓真空抽滿)，輕輕垂直平面90°旋轉10次，6-25℃（常溫）運輸，3（7）日內送達，可用乾冰/制熱劑製造維持環境溫度。6）血漿+血細胞 （普通試管）：抽血後 2h 內將全血4℃ 1600g離心 10min，分別收集上清和沉澱至離心管中；上清再 4°C 16000g 離心 10min，收集上清血漿轉移至 15mL 離心管中。血漿+血細胞樣品，均封口膜封口，乾冰運輸。7）胸水：8）腹水：這兩個情況比較少，至少我們公司很少遇到這樣的樣本。

2.2：質控。血液樣本是否合格，是否可以進行測序上機，樣本質量怎麼樣？安捷倫2100生物分析儀或者4200 TapeStation核酸分析儀，通過DNA完整值（DIN）來數字化基因組DNA的完整性。如果不用這些儀器，可以通過跑膠來實現這一步。質控不合格，只有重新採樣。標準流程只需要0.1-1μg DNA，DNA的OD 260/280在1.8-2.0之間，RNA的RIN值≥8.0。實驗中發現，只要RIN值大於7，就可以獲得比較滿意的結果。（RIN：RNA完整值）。總的來說，質控兩個指標：1）足夠的DNA量；2）完整的DNA基因組。這個步驟在構建文庫後上機測序前完成。

2.3：文庫構建。簡而言之，獲取足夠量的/目的的/前期適合上機測序而標準處理的DNA。其程序主要有：片段化，連接，擴增。1）片段化：我們總不能直接將那麼長的DNA去測序吧，測序儀就只能一次測幾百bp的DNA，超聲波片段化等方法，獲得DNA片段為正態分布200-500bp，通過一定方法（切割瓊脂糖凝膠電泳條帶）選擇所需長度的DNA片段（150-200bp），其它的片段就扔了（不影響覆蓋範圍）。2）末端修補：上面的方法（物理方法）片段化的DNA，一般來說兩端都被破壞了，不再是平平整整的了，而後續步驟需要在兩端加測序接頭，所以我們得先把這個破壞的兩端修補好。修補所需三種酶：5『端延伸的酶，5』端連接的酶，3『端延伸的酶。3）3』端加A：片段化且兩端修補好的DNA，3『端加上一個鹼基A，而下一步驟的連接接頭3』端有一個鹼基T，這樣就實現了鹼基互補而連接起來了。這樣做還有以下幾個原因：提供連接效率；防止接頭與DNA片段多種方向連接；減少接頭之間的連接。值得一提的是1）2）3）的步驟可以用WGS Framentation Mix搞定。4）兩端加接頭：首先明確接頭3『端有一個突出的鹼基T，插入片段3』端有一個突出的鹼基A；其次，這個工序是在插入片段兩端加入東西；這個東西包括以下幾個部分：測序接頭（P5，P7；測序時用於與種植在Flow Cell上的序列鹼基互補配對用），Barcode（用於標識該條DNA片段屬於哪個樣本，4個鹼基），單分子編碼序列（Index，用於識別是哪條DNA片段，12個隨機鹼基）；其中Y型的序列是已經商業化的試劑盒。5）PCR富集：如果樣本不夠，那麼我們就需要擴增它才能上機測序，這就是該環節存在的必要。由於每個經4）處理的片段兩端都有P5與P7，因此PCR引物只需設計與它們配對的就行了。如果樣本足夠，這一步就省了唄。6）文庫定量：這裡才應該是質控，也就是2.2的步驟。7）基因捕獲：我們只將需要的DNA片段去測序，不需要的去測不是浪費錢嗎？於是在測序之前，我們就用這個工序將目的DNA挑選出來（為什麼要捕獲）；目前目標序列捕獲方法有3種，NimbleGesn Sequence Capture array，Agilent SureSelect DNA Capture Array，Agilent SureSelect Target Enrichment System，值得注意的是不同捕獲方法可能測序儀器有不同的要求（捕獲的方法有哪些；羅氏和安捷倫）；我們捕獲的探針設計可以自己設計，初步設計，需要檢測的位點提交到商業公司，真正的設計還是需要專業的商業公司來干（捕獲探針的由來）；例如目標區域為100Kb，好的探針是100%覆蓋這100Kb，而有的商業公司達不到，只能覆蓋到97%，那麼意味著有3%的區域捕獲不到，更談不上對這些區域測序了，所以覆蓋率很重要；對於這100Kb的目標片段，前10Kb探針捕獲了100個片段，第10Kb-20Kb的探針捕獲了10個片段，那麼這樣的話就是均一性不好，最終可能會得出結論10Kb-20Kb這一段突變頻率過高/過低，因此均一性很重要；如果一個探針設計出來想捕獲目標片段，卻捕獲到了別的垃圾片段，我們還對它測序，這不是浪費錢嗎？所以，探針特異性很重要。（好的捕獲是怎麼樣的）。8）PCR擴增：PCR再次擴增捕獲的DNA片段，上機前再一次加足樣本量。9）文庫再次定量：相當於上機前的再一次質量檢測。

2.4：上機測序。通過前面的步驟，我們從患者身上的一塊腫瘤組織或者一管血開始，然後分離提純我們需要的基因組DNA，再把這些DNA打成小片段，然後再在這些DNA小片段兩頭接上識別標記和測序接頭，最後再通過基因捕獲技術篩選出目的DNA，根據需求PCR擴增。通過這麼多步驟，就是為上機測序做準備。一句話，上機測序的過程就是讀取這些DNA小片段的序列，如ATCTGGCTT...(~160bp)，這樣萬級、億級的DNA片段個數。至於這些DNA片段是怎麼樣在機器上被測出來的，這又是個大問題，我在《液體活檢有哪些》這篇文章有簡要說明，這裡不管它，畢竟世界上那麼多事情，哪有想管就管得了的呢？至此，實驗部分結束。

程序三：信息分析部分

3.1：下機數據識別。數以億計的DNA小片段，一大餅，雜亂無章，很多情況是幾十個患者的樣本都一起的，更亂。一句話，這個步驟將屬於不同患者的DNA小片段放進不同的盒子里，分類。這是怎麼實現的呢？我們在構建文庫的加接頭步驟時，同時加上了Barcode序列，同一個患者使用同一個Barcode，不同的患者使用不同的Barcode，那麼計算機通過這個Barcode輕鬆識別然後放進不同的盒子里。值得注意的是，DNA是兩條鏈，有的公司會兩條鏈同時測序以增加準確性，因此一個A患者會有兩個盒子屬於他（A1：正義鏈的DNA小片段集合；A2：反義鏈的DNA小片段集合）。還值得注意的是，如果樣本是血液，有的公司會同時檢測cfDNA和gDNA，那麼一個B患者就會有四個盒子屬於他（B1，B2，B3，B4）。

3.2：圖像轉換。下機的時候那些DNA片段最初其實是圖像格式的，例如紅色表示鹼基A，綠色表示鹼基T，需要用專業工具將圖像格式轉換成序列。Illumina公司提供專業軟體，只需對其調用就可以完成這一步驟。一句話：圖像轉換成序列。

3.3：比對到基因圖上。將這些上以億級的DNA小片段歸位，如果你是1號染色體的第500位到第650位之間的片段，就把你歸到這個位置下面。當然，1號染色體上的這個位置下面一般不止一條DNA片段，畢竟有一個概念叫做測序深度，如果測序深度為10000，那麼理論上該位置下面就應該有10000條DNA片段。怎麼控制是10000條呢？這在上機之前構建文庫時，通過調節PCR擴增來實現。一句話：將散亂的DNA小片段比對到參考基因組上，從而實現它們的定位。這個參考基因組是國際權威資料庫給出的，供給全世界所有人使用。基因組：http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/；比對軟體BWA：http://bio-bwa.sourceforge.net/；

3.4：計算突變頻率。假如1號染色體的500位到第650位有10000個DNA片段，那麼測序深度就真的是10000嗎？在這裡需要做一個辨別，如果這10000條DNA片段有9000條是一模一樣的，那麼我們認為這是一條DNA片段PCR擴增出來的，這9000條只能算作1條，這時候有效測序深度為1001。在某個特定的位點，如果這1001條DNA片段有100條發生同樣的與參考基因組不一樣的變化，我們就認為該點的突變頻率為10%。這10%的突變頻率（血液腫瘤驅動基因突變為例）意味著：血液中的cfDNA有10%是ctDNA，從而反應患者的腫瘤病灶有一部分癌細胞發生了該突變，若有針對該位點的靶向葯，那麼可根據情況推薦使用。值得注意的是，如果有效測序深度只有100，那麼就有可能漏掉一些典型的突變，所以有效測序深度足夠是非常重要的。這裡有一個問題：某個特定位點的變化，怎麼樣才算真正的突變呢？冷泉港實驗室的VarScan軟體來判定SNV和INDEL，順便說一句要判定真正的突變很難，國際上有不同的看法。VarScan：http://varscan.sourceforge.net/；

3.5：1）原始數據過濾；2）數據比對BWA；3）比對文件處理；4）去除PCR重複dedup；5）mpileup文件生成samtools；6）體細胞SNV、Indel變異檢測；7）體細胞Fusion檢測；8）體細胞SNV、Indel變異注釋annovar；9）突變質量檢測。

程序四：臨床解讀部分

根據基因檢測報告結果、患者意願、醫生意見綜合判斷，最終決定採取何種臨床決策。例如：開始使用靶向治療、繼續使用化療方案、參加某個特定的臨床試驗、更換化療方案、維持治療、家屬進行基因檢測等。