[技術流] Knock knock, who's there? ——測序技術

按照承諾，這回的更新是純技術貼。談談科學家們到底是怎麼知道腸道菌群裡面有什麼的。

經過之前將近一年的文章，希望大家已經有點了解腸道菌群的重要性了。我們生活的方方面面，從喝牛奶到吃蔬菜，從減肥到長壽，似乎腸道菌群都要『摻一腳』。那有人不免要問，科學家具體是怎麼知道，人類腸道里的細菌都有哪些，都怎麼演變的呢？

先從簡單的說起。為了研究腸道菌群對宿主的影響，有些研究組會使用特定的模式生物。模式生物的好處么，是可以直接在腸道內接種特定的一種或幾種細菌。以小鼠為例，目前有公司專門培養無菌的小鼠，並讓它們繁衍後代。它們的後代從出生開始，就一直待在無菌箱里，食物和飲水也全都是滅菌後的。這樣一來，這些小鼠的腸道就是『乾淨』的——只要不把它們從無菌箱里拿出來，它們全身上下都沒有一個活著的細菌。實驗的時候，直接用注射器往小鼠的消化道里注射特定的菌種液，就可以明確地知道這些小鼠體內究竟有什麼細菌了。由於這種方式通常局限於研究少量幾種細菌，人們也經常在這幾種細菌上做一些熒游標記之類，然後直接通過解剖小鼠或是研究小鼠糞便，就可以知道這幾種細菌『長勢』如何。類似的方法可以用於其它的模式生物。比如果蠅，由於是卵生，連代際培育都省了，直接把果蠅卵表面用酒精或漂白粉消毒，放進無菌培養基里，孵化後就是無菌的果蠅。再在它們的培養基里加入適量的細菌，就可以用這些細菌接種果蠅的腸道了。類似的，斑馬魚啊，線蟲啊，都可以用類似的方法操作。聽說還有人用雞做實驗的，想想拿塊酒精棉擦拭雞蛋表面的畫面，還有點想笑。

但是更困難的問題是，如果我們不是想接種特定的菌群，而是想知道自然環境下，某種動物或是人類的腸道菌群狀況，又該怎麼辦呢？其實也不難。糞便中含有大量的腸道細菌；只要我們能通過特定手段，『數』清楚糞便里有哪些細菌，各有多少，問題就大功告成。對於小鼠之類的模式生物，還有另一種手段——直接解剖腸道，然後通過顯微鏡來『看』有哪些細菌，各有多少。這個話題會在下一次詳細說。咱們今天就談談『數數』。

數清楚有多少細菌，聽起來容易，做起來還是有點麻煩的。畢竟腸道里什麼細菌都有，而一克糞便里，就有一半是細菌，可能有數十億個。單純手動數，怕是要數到地老天荒。更何況，我們要知道的可不僅僅是有多少細菌，還要給它們分類呢。難道真的在顯微鏡下一個個扒拉看？要真是這樣，先不考慮生理上的噁心因素，單算時間，一個博士生大概數清楚一份樣品就可以畢業了。當然，前提還得是，你能『認識』所有細菌的樣子；而很多細菌雖然種類迥異，長相卻大同小異。

折中一點的辦法，就是稀釋樣品，然後讓細菌們在培養基上生長。通過長成的菌落數量，可以大致估計原本樣品里細菌數量；同時，通過菌落的形態和顏色很多時候也能大致猜測細菌的種類。這樣的操作自然簡單了很多，但問題同樣存在：通過菌落形態來辨別細菌種類的方法並不可靠；另外，還有很大一部分細菌目前根本沒有辦法在實驗室培養，所以它們會直接被無視。

所以，目前大家覺得最好的辦法，是直接測序——找到細菌的基因序列。幸運的是，雖然在進化的過程中，很多基因變化極大，但在各種細菌里，有一段基因序列相對穩定。這段序列位於細菌的核糖體 16S RNA 上。這段序列在進化過程中也會慢慢發生演變，但同時保持了相對穩定。因此，只要比較兩個細菌 16S RNA 的特定序列，就可以大體知道這兩個細菌的親緣關係如何，究竟是同一個屬不同種，還是同科不同屬等等。

當然，這樣做的壞處就是，海量的測序數據，處理起來還真是頭疼呢……

題圖 credit: http://phylonetworks.blogspot.com/2014/08/