bpj新文：報告體系對乾性維持因子測量精確性的影響

在轉錄因子研究中常用的一種方法是使用knock-in的報告體系（如gfp）來量度因子表達的情況，這種方法因為簡單而被廣泛使用。然而在相關文章中一般缺少證明報告體系有效性的實驗，似乎報告體系的適用性已經成為廣泛共識。在近期一篇新文章中指出了knock-in報告體系存在的較大弊端並對活細胞因子濃度測量提出了更高的要求[1]。

在真核生物中基因一般以多組等位基因的形式存在，而等位基因之間的相互作用可以導致同源染色體上基因表達的異質性。對於單個等位基因敲入報告基因的報告體系，這種作用可能導致報告體系無法如實反映另一條同源染色體上等位基因的表達情況，造成報告體系失實。

文章作者首先討論了轉錄調控的背景雜訊對等位基因轉錄的影響。考慮一個簡單的二等位基因獨立轉錄的模型，在兩個等位基因未耦合的情況下，它們的平穩聯合概率密度函數（？=stationary joint probability mass function，PMF) 等於兩個獨立泊松分布的乘積。在引入一個轉錄調控雜訊的情況下，根據貝葉斯定理可以通過對時間的積分得到PMF。若令x滿足gamma分布，則兩個等位基因轉錄產物的邊緣分布滿足負二項分布。由此計算兩變數間的協方差，可以得到推論即轉錄調控雜訊可以增加報告基因的準確性，換句話說，報告基因的準確性受到上游調控背景的影響，而這可能會受到報告系統的引入本身的影響。

為了在一個生物學的語境下討論這一問題，該文作者研究了在哺乳動物乾性維持網路中起到重要作用的Nanog因子。在此之前已經有很多文獻報道了Nanog的調控模式與生物學功能的關係以及因子漲落在發育中的重要性，這些為這一研究提供了參照（圖[2]）。

因為Nanog的表達和自身的調控偶聯，因而作者引入了一個簡單的模型來模擬Nanog兩個等位基因的轉錄動力學，包含本底項，Hill項和降解項。在無量綱化之後，Nanog總表達量的變化可以寫作依賴兩個無量綱係數的形式。在幾種不同的報告系統的假設下，由兩個係數決定的方程的不穩定區是不同的，說明這一模型下報告系統會影響Nanog表達的動力學穩定性。

實驗上，通過免疫熒光和流式細胞儀測定，在0i和2i組（加入或不加入抑制分化的因子）中knock-in GFP報告基因的信號與Nanog的免疫熒光信號均的吻合度都較低。此外諸如雖然2i組似乎顯示出更好的Nanog免疫熒光信號和GFP信號的一致性，但是GFP的表達具有更大獨立性，這些結果顯示了轉錄雜訊的影響可能造成一定的技術性偏差。而移除LIF（乾性維持因子）的時序觀察顯示Nanog免疫熒光信號和GFP信號的互信息始終偏低，雖然在移除後的第一日互信息有微弱的共同上升的趨向，但整體上和在靜態0i和2i模型中測量的情況類似。

實驗結果中種種存在的問題說明在使用基因報告系統的時候需要比以前更加謹慎，作者提出了兩點建議，一方面在大通量的細胞分選實驗中需要建立更加嚴苛的標準，另一方面對於報告體系本身對於野生型細胞的影響不可忽略而亟待改良。總之目前的方法仍然存在一些問題。

Refs.

[1] http://dx.doi.org/10.1016/j.bpj.2017.05.005

[2] http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2015.04.014

推薦閱讀：