技術剖析:液體活檢之ctDNA篇

一．液體活檢之ctDNA概述

循環腫瘤細胞、循環腫瘤DNA 和外泌體的檢測並稱為「液體活檢」。「液體活檢」是一種新興的無創檢測技術, MIT Technology Review 雜誌將「液體活檢」技術評為2015 年度十大突破技術之一。

ctDNA（circulating tumor DNA，循環腫瘤DNA）是指人體血液循環系統中不斷流動的攜帶一定特徵（包括突變， 缺少，插入，重排，拷貝數異常，甲基化等）來自腫瘤基因組的DNA 片段。ctDNA 的主要來源包括：1、來自壞死的腫瘤細胞；2、來自凋亡的腫瘤細胞；3、循環腫瘤細胞；4、來自腫瘤細胞分泌的外排體。

ctDNA 對於早期和局部腫瘤的檢測還有一定的局限性, 目前主要用於晚期腫瘤的檢測。臨床試驗研究表明: 1) ctDNA濃度大小與腫瘤負荷大小成正比, 但並不能確定腫瘤的分期、定位和大小; 2) ctDNA 檢測尤其是ctDNA 突變的檢測可監測腫瘤進展及預後, 而且有研究指出ctDNA 的水平可以作為評估某些腫瘤(如卵巢癌和子宮內膜癌)預後的一個獨立指標; 3) 通過對ctDNA 水平的監測能夠檢測到腫瘤患者組織和血漿中存在的特有的突變以便準確地對腫瘤進行分型, 從而指導臨床靶向治療; 4) ctDNA 檢測可反映腫瘤是否發生複發轉移及是否伴有微小殘留疾病的存在; 5) ctDNA 檢測可反映抗癌治療是否起效及是否出現耐藥性信息, 以便及時調整治療方案, 減少昂貴的無效治療, 實現個體化用藥和治療。

圖一.血液中的ctDNA

二．ctDNA的提取

ctDNA在外周血中含量很少, 片段很小, 容易與血漿蛋白結合, 常規的提取效率不高, 同時

為排除凝血過程產生污染, 目前多採用血漿進行ctDNA 抽提。類似於PCR分子診斷的核酸前處理，常用於分離ctDNA 的方法也有兩種，二者並沒有本質區別，只是二氧化硅微粒的載體不同。

離心柱法：以硅膠濾膜作為固相載體的，基於二氧化硅選擇性結合DNA 的獨特屬性。其原理是帶負電的DNA骨架與帶正電的硅膠濾膜之間的高親和力。鈉離子起到陽離子橋的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架裡帶負電荷的氧。在高鹽條件（pH≦7）下,鈉離子可破壞水中的氫與硅中帶負電荷的氧之間的氫鍵。通過大量漂洗去掉所有雜物後，用TE或Tris-Hcl 緩衝液或蒸餾水在低離子強度下（pH≧7）洗脫純化的DNA。

磁珠法：帶有磁荷的顆粒可通過磁場中的永磁將其移除。這些磁顆粒可用表面包被二氧化硅的氧化鐵顆粒製成。因表面積大，結合核酸的能力較強，可作為較好的分離載體。如果賦予容器側壁磁性，樣品混合物中結合有核酸的磁珠則聚集到容器壁，直接傾倒容器可將其他雜質去除，避免了反覆離心。磁珠表面包被有活性基團可特異性吸附核酸。

圖二.ctDNA提取的兩種方法的比較

三．已知突變的ctDNA的檢測

由於腫瘤分離出的DNA 的質量和數量變化極大, 因此需要高特異性和高靈敏度的方法檢測ctDNA。對於已知突變的ctDNA而言，檢測手段有數字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion, amplification and magnetic)、ARMS-PCR(amplification refractory mutation system, ARMS)。

3.1 digital PCR

20 世紀末，Vogelstein 等提出數字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標分子( DNA 模板) ，在每個反應單元中分別對目標分子進行PCR 擴增，不同於 qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR 技術是在擴增結束後對每個反應單元的熒光信號進行採集，最後根據泊松分布原理及陽性微滴的個數與比例得出靶分子的起始拷貝數或濃度。

由於其成本低，靈敏度高，適合檢測血液中微量的DNA，digital PCR 成為ctDNA 使用最廣泛的檢測技術之一。但是digital PCR也有其不可避免的缺陷：低通量，不能檢測未知突變。

圖三. digital PCR原理

3.2 BEAMing

圖四. BEAMing原理

BEAMing結合數字PCR與流式技術，通過磁珠克隆DNA。利用特異性PCR 引物擴增目標突變區後，與磁珠（磁珠上固定有特異的PCR 引物）混合進行油包水單分子擴增反應。反乳化作用後，利用不同顏色的熒光探針結合磁珠上的PCR 產物，發出紅色或綠色熒光。使用流式細胞儀分析磁珠顏色來確定突變情況。作為DNA檢測最靈敏的技術之一, BEAMing擴增法的應用使ctDNA檢測的靈敏度大大提高。同樣的，BEAMing技術在ctDNA檢測方面也存在一定缺陷：低通量，不能檢測未知突變。

3.3 ARMS-PCR

突變擴增系統(amplification refractory mutation system, ARMS)是Newton等首先建立用來檢測已知突變的方法。其基本原理是，如果引物的3′端鹼基與模板鹼基不互補，則用一般耐熱DNA聚合酶無法延伸。因此根據已知點突變設計3條引物，其3′端鹼基分別與突變和正常的模板鹼基互補，從而將有某種點突變的模板與正常模板區分開來。此法已用於多種疾病的點突變的檢測。

圖五.ARMS-PCR原理

四．未知突變的ctDNA的檢測

前面提到的幾種技術雖然準確率高，成本低，但是通量低，不能檢測未知突變，未來發展能力有限。以肺腺癌為例，最大類的兩個突變KRAS 和EGFR 分別佔了16%和8%，有65%的突變是未知的。目前，檢測未知序列的方法主要由兩種：標記擴增深度測序(tagged-amplicon deepsequencing, TAm-Seq)技術和癌症個體化深度測序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)。

4.1 TAm-Seq

TAm-Seq是一種新一代的高通量測序技術,主要特點是測序通量高、測序時間和成本顯著降

低, 一次能對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定。該方法的基本原理是設計特異性引物對目標區域進行循環預擴增，產生大小200bp以下末端重疊覆蓋整個區域的擴增子（預擴增），接著通過單重PCR選擇性擴增帶突變的擴增子區（標籤擴增），從而排除非特異性產物，最後在回收的產物上加接頭和特異性條形碼，進一步通過單端測序得到最終結果。

圖六. TAm-Seq原理

4.2 CAPP-Seq

CAPP-Seq 法先在在腫瘤基因突變資料庫（COSMIC，「篩選庫」）來源尋找重複出現的突變相關的外顯子，再從腫瘤基因圖譜庫患者全基因組測序結果篩選突變，設計探針，靶向富集含常見突變基因中的外顯子和內含子，有效的把測序區段濃縮到整個基因組大小的0.004%，使得後續超高深度測序得以實現。其對腫瘤的ctDNA 檢測靈敏度更高，特異性更強，與全外顯子測序等相比經濟可行。

圖七. CAPP-Seq原理

五．液體活檢ctDNA技術展望

ctDNA 的精確檢測同時也給精準醫學帶來了新的機遇: 1) 精準預防。尤其是對腫瘤高危人群的鑒別, 一旦鑒別出來就可以對其進行干預、跟蹤、評估; 2) 精準康復。手術後患者是否具有複發的風險, 如何進行有效的預防和康復干預, 以及治療效果的評估, 都需要以檢測ctDNA 為基準來實現個體化預防和治療, 提高癌症患者的生存率。

圖八.液體活檢的檢測技術的靈敏度比較

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