請問對美國箭頭公司和arc520有關注了解的嗎？謝謝！?
Arrowhead 公司是一家研發靶向RNAi（RNA干擾）製劑的生物醫藥公司，ARC-520是他們公司的針對HBV感染的RNAi產品，也是該公司走的最遠的產品。ARC-520的治療目標是「功能性治癒」慢乙肝，即HBsAg清除，伴或不伴有HBsAg血清學轉換。
圖1
現有的慢乙肝抗病毒手段有兩種，一種為干擾素/聚乙二醇干擾素，另外一種為口服抗病毒藥物，但這兩種方案都有其限制，比如，干擾素雖然能夠調節免疫，實現相對較高的e抗原及表面抗原血清學轉換率，且為有限時間用藥，但副作用大，不適用於失代償肝硬化患者及孕婦，且治療效果因HBV基因型而異；另一方面，口服核苷（酸）類似物能夠強有力的抑制HBV病毒複製，快速實現DNA轉陰，在阻止肝硬化進展及降低肝癌發病率方面功不可沒，但對其cccDNA無直接作用，e抗原及表面抗原血清學轉換率不高，且治療周期長，停葯指征嚴格，尤其是e抗原陰性的慢乙肝患者，很有可能需要一輩子抗病毒治療。目前也有研究者將干擾素+口服抗病毒藥物聯合使用，這種做法的確可以很大程度的提高血清學應答，但表面抗原的血清學轉換率仍沒超過百分之二十，遠遠談不上臨床治癒，且副作用與國人經濟能力方面的原因也限制了這種聯合治療方案的發展。因此，RNA干擾治療方案的出現無疑給慢乙肝抗病毒治療帶來了新的視角。
什麼是RNAi？這個問題任何生物醫學本科一年級新生都知道，原理我就不重複了（非生物醫學專業不明白的可以自行wikipedia，百度都行），必須強調的是，一個有效的靶向RNAi治療方法更倚仗的是「靶向」這個過程，即將siRNA有效的送到靶細胞及靶細胞質的遞呈系統。箭頭公司研發的Dynamic PolyConjugates (DPCs)呈遞系統（一種通過靜脈注射，能夠靶向肝細胞的合成高分子聚合物siRNA平台）是ARC-520動物實驗及臨床試驗能夠推進的關鍵。
在了解ARC-520之前，我們先來看看HBV病毒複製的過程，以明確ARC-520的靶位。
HBV 複製過程可分6 個環節（見圖2[1]）：①病毒進入肝細胞漿，其核衣殼被裂解而形成鬆弛型環狀DNA（rcDNA)，後者進入肝細胞核，並在病毒DNA 聚合酶和宿主酶的作用下，修復rcDNA 成為cccDNA；②以cccDNA 為模板，在宿主細胞RNA 聚合酶作用下， 轉錄成4 種不同長度的病毒信使RNA（mRNA）和前基因組RNA（pgRNA)，翻譯HBV 的各種蛋白；(也有綜述提到：cccDNA為模板轉錄6種mRNA,翻譯成7種蛋白 )③病毒聚合酶和衣殼化信號共同作用於pgRNA, 啟動逆轉錄和核衣殼組裝；④通過逆轉錄，合成病毒負鏈DNA，同時病毒聚合酶消化病毒RNA 模板；⑤病毒負鏈DNA 合成後，剩餘的RNA作為引物， 啟動正鏈DNA 合成； ⑥完成正鏈DNA合成，形成rcDNA, 同時核衣殼被包被上外膜並作為感染性病毒體分泌至細胞外；或再回到同一個肝細胞核內，擴增或維持cccDNA 庫。
圖2
可見，如果能有效的「破壞」這一大堆mRNA，阻止其繼續表達為病毒蛋白，則能大幅度降低機體病毒抗原的水平，給機體免疫力恢復以足夠的空間。ARC-520的原理也正是基於此。
ARC-520是由DPCs平台+其搭載的兩種siRNA組成的，DPCs平台協助ARC-520靶向肝細胞，而這兩種siRNA（chol-siHBV-74、chol-siHBV-77，靶位見圖3[2]）能夠通過兩個不同的靶點經RNA干擾機制破壞HBV cccDNA轉錄而來的各種轉錄子，例如各種mRNA及前基因組RNA，因此可以阻斷後續一系列的蛋白質合成，降低病毒載量及病毒相關抗原載量。我們已知包括e抗原及表面抗原在內的病毒蛋白與機體的免疫耐受狀態相關，因此，ARC-520的介入可能能夠重建機體對HBV的免疫力進而消除HBV病毒。
圖3
雖然上述ARC-520的原理振奮人心，但是值得一提的是，人體血液循環中的HBV表面抗原實際上有兩個來源（見圖4）：
1）由cccDNA轉錄而來的s-mRNA翻譯而來，少部分HBsAg與核衣殼組成成熟病毒顆粒釋放，大多數HBsAg未組成成熟病毒顆粒，直接以無感染力的形式分泌入血；
2）由整合到人基因組的HBV DNA轉錄而來的mRNA翻譯而來。
圖4
ARC-520對cccDNA轉錄而來的mRNA有破壞作用，但對嵌入人體基因組的DNA片段轉錄而來的mRNA無破壞作用。這一機制也決定了ARC-520適用範圍的受限。
下面我來正式介紹ARC-520的研究歷程。
動物實驗結果：
1）ARC-520在小鼠上的動物實驗結果：
單次注射呈遞系統及膽固醇結合siRNA能夠實現HBV RNA、HBsAg及病毒DNA數個Log的下降，並實現HBeAg低於檢測下限（見圖5[3]）。
圖5
2）ARC-520在黑猩猩上的動物實驗的結果在2013年AASLD會議上發表[4]，研究者將ARC-520用於一只自1979年便感染了HBV（基因型B）且病毒載量非常高的36歲的黑猩猩，研究者發現，2mg/kg的單次靜脈注射耐受性良好，並且能導致HBsAg、HBeAg及HBV DNA顯著下降，第一次注射兩周後，再次予以靜脈注射一次3mg/kg的劑量能夠增加療效，能使上述指標下降81-96%。這些指標的下降程度及效果的持續時間與之前在小鼠上的動物實驗結果相符(見圖6[5])。
圖6
3）另一項動物實驗結果在2016年的EASL會議上發表[6]，該研究的目的在於探究多次ARC-520給葯是否會讓HBV病毒產生耐葯。該研究共納入了9隻CHB模型的黑猩猩(5隻e抗原陽性，基線DNA 8-9 log10 IU/ml，4例e抗原陰性，基線DNA 3 log 10 IU/ml)，在ARC-520治療前予以核苷（酸）類似物治療先導治療8-24周，而後在核苷（酸）類似物抗病毒治療的同時每月予以ARC-520治療（6-11個月）。結果：ARC-520多次給葯後，肝HBV RNA、血清HBV DNA、血清HBV抗原水平均顯著下降，e抗原陽性的猩猩表面抗原平均下降1.7±0.5 log10，e抗原陰性的猩猩表面抗原平均下降0.7±0.1 log10，siHBV-74及siHBV-77位點的主要「變異株」的百分比治療前後沒有顯著變化，提示沒有發生ARC-520相關的耐葯。
I期臨床結果：
2013年的HepDART會議上，箭頭公司發表了ARC-520的I期臨床結果[7]，這是一項單中心、隨機、雙盲、安慰劑對照研究，36例健康志願者按1:2分為安慰劑組（12例）及治療組，治療組又分為0.01mg/kg（4例）、0.1mg/kg（4例）、0.3mg/kg(4例)、0.6mg/kg（4例）、1.2mg/kg（4例）、2.0mg/kg（4例）等予以單次靜脈注射給葯，所有試驗者均未發現嚴重不良事件，未發現ARC-520劑量依賴的毒性，未發生藥物相關性停葯，直至2.0mg/kg ARC-520耐受性均良好。
II期臨床結果：
1. ARC-520在香港進行的IIa期臨床試驗結果[8]在2014年AASLD會議上發表，這是一項隨機、雙盲、安慰劑對照的雙中心的臨床試驗，HBeAg陰性、長時間口服恩替卡韋抗病毒的慢乙肝患者按1:3隨機分入安慰劑組及ARC-520治療組，並且繼續口服恩替卡韋抗病毒。在治療組中，研究者探討了單次靜脈注射1mg/kg（8例）、2mg/kg（8例）、3mg/kg（6例）三種劑量，前兩個劑量組在治療第85天時揭盲評估療效。該研究主要研究目的為考察單劑量ARC-520聯合恩替卡韋治療所導致的HBsAg降低的幅度及持續時間。結果：1mg/kg組中，平均HBsAg最低下降比例為39%，85天時平均下降比例為31%，2mg/kg組中平均HBsAg最低下降比例為51%，85天時平均下降比例為22%，平均達到最低HBsAg的時間為33天，注射第3-43天，2mg/kg組的HBsAg下降程度均明顯大於安慰劑組（見圖7）。三個劑量組中均未見明顯的嚴重不良事件。
圖7
Arrowhead公司在做2014 AASLD會議的presentation的最末尾指出：
ARC-520的目的並不是通過單劑量注射直接消除HBsAg，而是使HBsAg降的足夠低（比如至少1個log）而給機體自身的免疫系統足夠的空間發揮作用實現功能性治癒。臨床實驗前就已經預計HBsAg下降曲線為U型，大概持續的時間為1個月，而IIa期臨床發現這個U型曲線的跨度遠遠長於1個月。Arrowhead公司指出，他們今後的努力方向是繼續做完3mg/ml的研究組，並且招募4mg/dl的研究組，此外，他們還將開展IIb期研究，即研究多次給葯給慢乙肝患者帶來的HBsAg的變化。
2. 在2015年的AASLD會議（LB-9[9]）、2016年APASL會議（O-103[10]）及2016年的EASL會議（THU-193[11]）上，箭頭公司又陸續發表了多篇關於在香港平行開展的另一項ARC-520 II期臨床研究的摘要。該安慰劑對照的研究包含了1.0 mg/kg-4.0mg/kg多個劑量組，筆者在此綜合這幾篇摘要簡要介紹一下這一項新的II期臨床研究的概況。
主要研究目的：觀察ETV經治/初治患者單次或雙次ARC-520給葯配合ETV抗病毒治療，造成的HBsAg下降的幅度與持續時間。
研究設計：納入58例中國CHB患者，其中48例予以ARC-520治療，10例為安慰劑對照，按ETV經治史、ARC-520給藥劑量、e抗原狀態等分為7個隊列進行干預及觀察（見圖8，第7隊列為沒有ETV經治史的初治組），觀察時間為85天，觀察內容為病毒DNA及病毒抗原的滴度的變化。
圖8
研究結果：
1.安全性：不良事件的發生率是14%，沒有發生嚴重不良事件，沒有發現劑量依賴性毒性，沒有不良事件相關的停葯，所有的不良事件均與研究無關（研究者認為）。有較低的實驗室異常發生率，不與ARC-520/安慰劑的給葯時機及劑量相關。
2.所有研究對象病毒抗原下降的整體情況（見圖9）：
圖9
可見隊列7（初治患者4mg/kg組）的e抗原陽性的患者表面抗原下降的幅度最大。
3.初治組單次4mg/kg ARC-520給葯（第七隊列）的療效：
1）病毒學療效（見圖10）：
所有e抗原陰性的患者（藍線），包括原先e抗原陽性而後轉為e抗原陰性的患者，都在平均15天的時間內實現了HBV DNA低於檢測下限，5/6例e抗原陽性的患者（綠線）雖然未實現DNA轉陰，但HBV DNA顯著下降，幅度最大的下降了5.5 log，平均下降了4.7 log。
圖10
2）血清學療效：
- 表面抗原（圖11）：
觀察到兩種表面抗原下降模式，5/6例e抗原陽性的初治患者產生了迅速的、顯著的抗病毒效果，表面抗原最大較基線下降了1.8 log，平均也下降了1.5 log。在單次ARC-520治療後85天，表面抗原仍處於降低狀態。然而對於e抗原陰性的初治患者，5/6例患者在ARC520治療後數周才有延遲的抗病毒療效，表面抗原最大較基線只下降了0.5 log，平均只下降了0.3 log。有一例患者基線系e抗原陽性，在治療第3-43天轉為e抗原陰性(圖中褐色曲線)，該患者表面抗原的下降程度一般。
圖11
- e抗原（圖12）：
圖12
對於e抗原陽性的6例患者，e抗原下降幅度最大的達到了2.0 log，平均下降1.6 log。
結論：ARC-520 耐受性好；ARC-520+恩替卡韋聯合治療能使HBV DNA迅速下降（與臨床前研究提示的兩種療法的協同性一致）；ARC-520能有效的抑制cccDNA轉錄而來的mRNA，表現在病毒蛋白水平的顯著下降；初治的、e抗原陽性的CHB患者，所有的病毒抗原均能得到有效的抑制，而e抗原陰性的患者，表面抗原下降的程度較小；本研究結果與「初治e抗原陽性的患者中更多的病毒蛋白系cccDNA而來，而e抗原陰性的患者中，更高比例的表面抗原系整合到人類基因組中的DNA片段轉錄而來」相一致（筆者註：即前文中提到的ARC-520的局限性）。
總而言之，通過RNA干擾抑制cccDNA來源的mRNA轉錄，降低各種病毒抗原滴度，給予機體充分的空間重建對HBV的免疫力對於慢乙肝而言，的確是一種有意義的嘗試。目前I期、II期臨床研究均提示ARC-520的安全性可，血清學療效佳，比起干擾素，ARC-520在免疫療法的道路上往前多走了一步。但是，ARC-520針對的畢竟只是cccDNA來源的mRNA，那些已經整合進入人體基因組的DNA片段來源的mRNA又該如何呢？此外，不得不說，連轉基因都接受不了的國人，如何去接受基因治療？
我們且期待進一步的諸如多次給葯IIb期臨床及後續III期臨床（如果給批的話）試驗結果的發表，ARC-520離上市，還有漫長的路要走，免疫治療的冰山，我們仍只看見了一角。
參考文獻：
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[6] Z. Xu, D. Chavez, B. Guerra, et al. Treatment of chronically HBV-infected chimpanzees with RNA interference therapeutic ARC-520 led to potent reduction of viral mRNA, DNA and proteins without observed drug resistance. Journal of Hepatology 2016 vol. 64:S398
[7]Arrowhead presents Phase 1 data on ARC-520 at HepDART 2013
[8] Yuen M, Chan H, Given B, et al. Phase II, dose ranging study of ARC-520, a siRNA-based therapeutic, in patients with chronic hepatitis B virus infection. AASLD 2014; Poster #LB-21.
[9] MF Yuen, H Chan, K Liu，et al. ARC-520 produces deep and durable knockdown of viral antigens and DNA in a phase II study in patients with chronic hepatitis B. HEPATOLOGY, VOLUME 62, NUMBER 6 (SUPPL) 1385 A
[10] MF Yuen, H Chan, K Liu, et al. Effective inhibition of cccDNA derived mRNA/viral antigens and tolerability with ARC-520. Hepatol Int (2016) 10 (Suppl 1):S44
[11] MF Yuen, H Chan, K Liu, et al. Differential reductions in viral antigens expressed from cccDNA vs integrated DNA in treatment na?ve HBeAg positive and negative patients with chronic HBV after RNA interference therapy with ARC-520. Journal of Hepatology 2016 vol. 64:S390
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