核酸定量哪家強？Nanodrop vs. Qubit

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開頭先做一點重要聲明：

不是軟文

必須說三遍！本文僅是個人使用心得，不涉及任何商業利益，沒收過半毛錢。而且基於紫外吸收和熒光染料的兩台代表性儀器目前都同屬於一家廠商旗下，所以不用撕。

以下開始正文。

凡是需要做分子生物學實驗的lab，肯定逃不了要買一台核酸定量的機器。目前最為流行的儀器是Nanodrop，只需滴加一兩微升的樣品，按一下按鈕，利用核酸的紫外吸收特性，即可得到濃度數據。近幾年，以Qubit為代表的基於特異熒光染料法的儀器也逐漸進入科研人員的視野。那麼，這兩類儀器有什麼區別，在使用時需要注意什麼，如何根據實驗室需求來選購？且聽老司機分解。

（註：以安捷倫公司為代表的毛細管電泳法不在本文的討論範圍內。）

首先我們需要來理解兩台儀器在核酸定量原理上的區別。正如方才所言，Nanodrop利用了核酸的紫外吸收特性。

（圖1：Nanodrop全家福）

核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及鹼基構成。其中，由於鹼基含有芳香環結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸的特徵吸收波長為260 nm。根據朗伯比爾定律，已知物質的消光係數（幾十年前早已測量），液層的厚度（固定的樣品室），就能利用其吸光度來計算出物質的濃度。與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數值，估計核酸的純度。（280 nm吸光通常來自蛋白質，而230 nm則通常來自糖類和苯酚等。）

而Qubit這一類儀器採用的是熒光染料法。這些熒光染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結合，並在特定波長光源的激發下，發出熒光。其中，結合了核酸的熒光染料，相比那些遊離的，信號可增幅數十倍至數百倍，因此可以和背景區分開來。目前，做測序的實驗室基本把Qubit當標配儀器了。

（圖2：Qubit 3.0及配套試劑）

雖然以Nanodrop為代表的紫外吸收法在科研領域已經沿用了數十年，但由於原理上的限制，這一類儀器有無法避免的缺陷。

1、紫外吸收法無法區分DNA和RNA

nnnnnn這一點其實在原理上就很好理解了。如下圖所示，具有紫外吸收的結構是核酸的鹼基，而DNA和RNA均含有鹼基，因此當一份樣品同時含有DNA和RNA的時候，無論你本意是想測哪一個，均會高估其真實濃度。

（圖3：核酸的結構）

而Qubit的熒光染料法則避免了這個問題。只要採用DNA、RNA特異的染料，就能有選擇性地測定樣品中的核酸濃度。下圖是Qubit的官方測試數據。這個實驗是在DNA樣品中混合入不同比例的RNA，並用Qubit法和紫外吸收法分別進行測定。當DNA的樣品足夠純時（DNA：RNA = 10：0），兩種方法測得的數值並沒有顯著區別。但當混入的RNA越來越多，紫外吸收的數值也跟著升高（藍色和綠色柱子），而使用雙鏈DNA染料的Qubit數值則沒有改變（紅色柱子）。使用RNA染料用Qubit進行測定，則會發現，隨著RNA混入的增加，讀數也跟著升高。

（圖4：Qubit和紫外吸收法對DNA-RNA混合樣品的測定）

目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質均有特異的熒光染料。也就是說，無需專門純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

2、紫外吸收法的定量限較高

記得有一次做實驗，放了0.5 μg質粒做酶切，跑膠回收於30nμl的溶液中，然後做Nanodrop測定濃度，最後數值約為25nng/μl……

nnnn於是本司機得到的結論是：我們實驗室的那台Nanodrop一定是內置了賢者之石（霧——）還是去隔壁借用一下Qubit吧。

其實是這樣的，對於任何儀器分析，我們都應該去理解其檢出限和定量限。Nanodrop標稱的檢出限是2 ng/μl（雙鏈DNA），然而定量限則遠高於此。其他的Nanodrop用戶也有類似的體驗，曾經在ResearchGate上看到說，低於50 ng/μl的話就容易測不準，變異度會增大。以下同樣是來自Qubit的官方數據。當DNA的濃度低於某個程度時，紫外吸收法的偏差和變異度就突破天際了。

（圖5：Qubit與紫外吸收法測定低濃度DNA時的偏差及變異度比較）

這兩張圖中，紫外吸收法得到的偏差和變異度在我看來已經算小的了（不能搞太大啊，不然沒人買怎麼辦？數據來自Thermo Fisher公司，但他們家兩類儀器都有，手心手背都是肉），要低於4nng/μl雙鏈DNA才會亂飆車。然而在實際使用中，低於10甚至20 ng/μl時就比較容易出亂子。而PCR產物膠回收等應用，最終的實際濃度往往就落在這個容易測不準的範圍內。雖然這對老司機們來說還不至於把下游實驗搞砸，但測不準還是很鬱悶的。

3、紫外吸收法對溶液的pH和鹽濃度敏感

在研究物質吸光度時，我們總要明確地定義緩衝液的離子強度以及pH，這就說明，吸光度本身是受到這兩個因素影響的。

通常而言，偏酸的溶液，容易給出偏低的A260/A280數值。相反，偏鹼的溶液則容易高估。相應地，也有報道稱，當用水作為溶劑時，紫外吸收測定的數值變異度增大，而當使用Tris或Tris-EDTA溶液進行測定時，重複性就提高了。這其中的原因，很可能是空氣中溶解入水中的CO2濃度差異造成的。離子強度對於紫外吸收的影響比較複雜，這裡不展開。

相比之下，熒光染料法對樣品的污染和pH等的容忍度較大。

4、紫外吸收法對降解比較嚴重的核酸無能為力

這一點，同樣也是由紫外吸收原理的局限性所決定的。紫外吸收測定的對象是鹼基，因此無論核酸是完整成鏈的，還是降解成單個遊離核苷酸，該方法均無法加以區分。儘管我們可以通過A260/A280數值是否過大來估計核酸樣品的降解狀況，但卻無法選擇性地只測定那些結構完整的核酸的濃度。

而熒光染料通常結合的是核酸的鏈結構，並不會與遊離的單核苷酸相互作用。不過話說回來，對於那些尚未降解成單個核苷酸而呈短鏈狀態的核酸，熒光染料法是無法將其與完整核酸區分開來的。

[咚咚咚！敲黑板！]

但是，紫外吸收法也不是一味的爛，熒光染料法也不是說全方位吊打（大面積吊打還是做得到）。

如果在實驗中獲得的核酸樣品總是很純凈且均一（如原材料是容易對付的培養細胞，還用品質好的試劑盒進行抽提；而非奇奇怪怪的極端樣品，還要是自己配的試劑），同時產量又很高，那紫外吸收法完全可以勝任，外加測定速度秒殺熒光染料法。此外，熒光染料法對溫度比較敏感，比如上一回是在25℃室溫製作並儲存的標準曲線，而這一回要測定樣品時實驗室空調壞掉，一下子有了3℃以上的溫差，那麼標曲就得重新製作。同時，熒光染料要現用現配，樣品至少要染2 min，花費的時間比紫外吸收法要長。

以下用一張表總結兩者的優劣。請根據自己的實際情況斟酌。