石墨烯距離生醫商品化的時間還有多久？(2╱5) – 感測篇

2016-03-13

回想從事石墨烯產業三年多以來，一開始並不是看到那麼寬廣的未來，對於石墨烯的用途總是有那麼多的不確定感。隨著經驗與知識的增加，進而改變外界對石墨烯的偏誤信息後，終於找到石墨烯該有的方向，並據此屢屢創造新的驚奇，如果讀者有一直閱讀我的文章，應該可以體會我現在的感受。

這是個責任，也是個沉重的負擔。回想近日我與中國某石墨烯概念股上市公司總監談到合作石墨烯平台乙事，她的看法是國內石墨烯產業現今還不成局，建立產業園的時機太早，要幾年才有可能。我反而好奇志陽已經創造了世界第一，但連上市公司都不願真正參與石墨烯先期的投入，只想等成果還坐享其成，何來的企業創新轉型？何來的中國製造 2025？他們不做，我義無反顧。

石墨烯不斷地在各種領域上證明其價值，我從來沒有看過有任何一種材料可以橫跨哪么多的應用領域。這篇文章我們來談談生醫領域的感測及成像，除了前一篇的抗菌篇外，加上後面三篇談到光熱、藥物載體及基因，連貫成整個石墨烯在生醫領域的布局。

生醫感測

感測技術的核心在「表面增強拉曼光譜」的應用。表面增強拉曼光譜 (SERS) 是一種利用表面電磁場增強提高拉曼信號的分析技術。與紅外 (IR)、紫外 (UV)、核磁共振 (NMR)、熒光、x 射線衍射 (XRD) 等光學分析手段相比，具有很多突出優勢。表面增強拉曼檢測限非常低，可用於痕量分析，甚至可以實現目標檢測物的單分子檢測；分析過程只需要數毫秒到數十秒不等，可實現對被分析物快速檢測和實時信息反饋；能夠提供豐富的指紋圖譜信息而具有較高的分析準確性；水分子的拉曼響應較弱，因此適用於含水樣本的分析，尤其是生物樣本，無需複雜的前處理即可檢測；與其他分析方法如 IR、核磁共振等相比，對樣本純度要求低，可大大減少樣本前處理工作並節約分析成本；拉曼檢測所需樣本量極少，且為非入侵破壞性檢測，可為目標檢測物的後續分析提供方便。

表面增強拉曼散射 (SERS) 光譜作為一種高靈敏信號檢測和具有單分子識別功能的光譜技術，在分析化學、生物醫學等領域有著重要的應用。目前，SERS 增強機理主要有「電磁場增強」和「化學增強」兩種。電磁場增強機理與金屬表面產生的「表面等離激元」有關，表面等離激元的共振依賴於納米材料的形貌、結構、組分、耦合情況等，可使得吸附到粗糙金屬表面的探針分子的拉曼信號增加 10E3—10E8 倍。SERS 技術逐漸成為表面科學和電化學領域有力的研究手段，並已在痕量分析乃至單分子檢測、化學及工業、環境科學、生物醫學體系、納米材料以及感測器等方面的研究巾得到了廣泛應用，甚至出現了拉曼技術與其他技術的聯用。

石墨烯是具有二維蜂窩狀網路結構的材料，其 sp2 雜化碳原子的 2pz 軌道構成了大的離域鍵。石墨烯大的表面積和良好的導電性使其有利於吸附更多的探針分子，促進石墨烯與探針分子之間的電荷轉移，從而使探針分子的拉曼信號增強 2—17 倍，這種增強機理歸之為化學增強機理。最近的研究表明, 將氧化石墨烯或石墨烯與金屬納米材料複合，藉助金屬等離激元的電磁場增強和石墨烯的化學增強的耦合作用可以極大地提高探針分子的拉曼信號，同時，複合材料的抗氧化性能和生物兼容性也有所提升。

Kimn等 (2012) 製備出 GO╱銀納米粒子╱GO 三層複合結構，得到了比單獨銀納米結構或者石墨烯更強的拉曼信號，在 72 天后基底依然表現出良好的 SERS 活性 (如圖 1)。

Liu 等 (2012) 採用電化學沉積技術製備的金╱石墨烯╱金複合結構也表現出了優良的 SERS 活性。(如圖 2)

湯建 (2014) 通過界面自組裝技術在 DLC：P 襯底表面構築 AuNP╱GO╱AuNP 複合結構，並將 AuNP╱GO╱AuNP 複合結構作為 SERS 活性基底，考察複合結構檢測探針分子 RhB 的行為。緊湊排列的橢球形 AuNP 的電磁場增強效應和 GO 的化學增強效應有利於提高複合結構的 SERS 活性，增強探針分子的拉曼信號。AuNP╱GO╱AuNP 複合結構可檢測到濃度低至 10 nmol╱L 的 RhB 分子的拉曼信號，且在 10—1000nnmol╱L 範圍內，拉曼信號強度與濃度有良好的線性關係。不同複合基底表面吸附的 RhB 拉曼光譜如圖 3。

這麼好用的感測技術我們怎會缺席？何況我們已經積累了三代生物晶元的技術，第一代生物晶元為陽極氧化鋁╱銀納米數組 SERS 晶元，我們以陽極氧化鋁n(AAO) 當作模版，將銀納米粒子鑲入陽極氧化鋁模版中。（如圖 4）

第二代生物晶元採用胜肽醣（萬古黴素）╱銀納米數組 SERS 晶元 (如圖 5)，特性為：

nn(1) 捕捉血液中的細菌，但與血球不反應；

nn(2) 抗藥性細菌之快速檢測；

nn(3) 快速偵測（不需標定熒光物質、不需培養細菌），增快約 100 倍 (傳統：2-5天，新型生物晶元：可望 30 分鐘）。

第三代晶元為可撓式具備三維熱點之拉曼增強基板，其中 NSP 可用石墨烯取代 (如圖 6)，其特點為：

nn(1) 載體具可撓性，增加與生物體接觸的面積，進而增加 SERS 效應，可應用在大型及形狀不規則之生物體；

nn(2) 具備三維方向熱點 (Hot junctions) 效應，SERS 效應優於傳統基板；

nn(3) 背景訊號微弱，不干擾待測物量測。

各位讀者可能不知道，病人往生兩天後，檢驗室才通知被極強的抗藥性細菌所感染，而直接檢測是表面增強拉曼散射最普遍的檢測方式，目標分子吸附在金屬納米粒上，即可得到目標分子的指紋圖譜，只要資料庫建置完整，可望 30 分鐘內就知道確切病情。

生醫成像

石墨烯量子點由於「邊緣效應」和「量子尺寸效應」可表現出獨特的光化學特質。石墨烯除了具有碳量子點所具有的優點外，其熒光具有激發波長依賴。當激發波長從 310 nm 變成 380 nm 時，熒光發射峰位置的相應從 450 nm 移至 510 nm，光致發光強度迅速降低。而吳興龍 (2013)從氧化石墨烯（Graphene Oxide）到還原的氧化石墨烯（reduced GraphenenOxide）的化學還原過程，通過高分辨的透射電子顯微鏡、拉曼光譜、傅立葉變換的紅外光譜等手段研究在還原過程中結構發生的變化，並將這些結構上的變化和熒光光譜的演變聯繫起來。發現氧化石墨烯主要表現出寬譜的紅光發射，主要來源於含氧官能團相關結構。還原後，石墨烯表現出激發光波長依賴的發射波長移動的發光譜，發光波長涵蓋從 430 到 650 nm 的範圍，強度逐漸減弱。特別要注意的是，藍光發光強度比其他波長的發光要強得多，並且隨著激發光波長從 300 到 350 nm 變化，熒光峰基本不移動，熒光壽命相比長波長的發光要短，這些特徵表明：藍光和長波長的發光起源是不一樣的。 (注﹕量子點尺寸越小，其禁帶寬度越大，發射波長越短，稱為「量子尺寸效應」)

nn在還原的過程中，石墨烯結構上發生的變化主要有三方面，其一，含氧官能團減少；其二，石墨結構的碳團簇（sp2 Cnclusters）的形成；其三，由於含氧官能團移除造成的碳空位缺陷。他們提出長波長的發光起源於 sp2 C clusters 的尺寸效應，這與大量的前期研究結果是一致的，而藍光則其起源於碳空位缺陷，第一性原理的計算也驗證了這一結論。(見圖 7)

他們還研究了各種化學修飾石墨烯的熒光，發現均表現出相似的規律，發光譜由兩部分組成，峰位不移動的藍光發射和峰位變化的長波長發光。相對於沒有進行修飾的石墨烯，長波長發光顯著增強。他們提出這是由於嫁接的官能團能夠提供新的激發躍遷過程，並且增強原本很弱的 sp2 C clusters 的尺寸效應的激發過程，使得相應的發光過程得到增強。這一結果對於設計和調控石墨烯熒光具有重要的參考價值。

nnZhu 等 (2011) 利用水熱法製備了量子產率為 11.4% 的綠色熒光 GQDs，並用於骨肉瘤細胞的成像研究 (如圖 7)。Peng 等 (2012) 將碳纖維用化學剝離的方法製備 GQDs, 發現隨著 GQDs 粒子大小的變化，可以發出藍、綠兩種不同顏色的熒光，並用於乳腺癌細胞的成像研究。但是, 製備發射不同熒光的 GQDs，並提高其量子產率仍然面臨挑戰。

謝文菁 (2012) 利用電化學方法在鹼性條件下電解石墨棒，通過常溫下水合肼還原，得到 5～10 nm 的熒光石墨烯量子點n(Graphene Quantum Dots, GQDs)。圖 8 是人體肺癌細胞和人體乳腺癌細胞與 GQDs 共同孵育後，在激發波長為 405 nm 時的激光共聚焦成像圖。在該激發波長下，兩種腫瘤細胞可以發出亮黃色的熒光，可清晰地看出其細胞形貌，說明 GQDs 很容易進入細胞，並且不附著在細胞表面。(註：人體肺癌細胞 (a)和人體乳腺癌細胞 (b))

nn圖 9 是人體肺癌細胞和人體乳腺癌細胞加入 GQDs 水溶液後的細胞毒性圖。當 GQDs 水溶液濃度較低時，兩種腫瘤細胞的存活能力變化不大。當把nGQDs 水溶液的濃度提高到 50 μg╱mL，人體肺癌細胞的存活率變化不大，而人體乳腺癌細胞的存活能力也僅降至 60%。說明 GQDs 有良好的生物兼容性，表現出較低的細胞毒性。

最後，我們來談談石墨烯的生物危害性。相關的研究倒也不少 (見圖 10)。

生物危害性

ZHANG Xiao (2012 ) 採用改進的 Hummers 方法製備了納米尺度的氧化石墨烯，對氧化石墨烯的表面進行羧基化，並連接上聚乙二醇 (PEG) 使其在細胞培養液中可溶並能穩定保存。體外細胞實驗表明PEG修飾的氧化石墨烯在水中具有良好的可溶性，對 A549 細胞沒有明顯的毒性。Hu 等人 (2010) 比較了石墨烯氧化物和還原型石墨烯氧化物對人肺腺癌細胞nA549 的細胞毒性。A549 與濃度為 20 g╱mL GO 納米片層共孵育24 h 後，細胞活力為80%；當濃度達到 85 g╱mL，細胞活力降至 50%；兩種濃度下，GO 只抑制了 A549 細胞增殖，並未誘發細胞凋亡和死亡，呈現了良好的生物兼容性。研究還發現，相同劑量下，rGO 納米片層對 A549 細胞的毒性高於 GO，這說明石墨烯表面的官能團也會影響到其細胞毒性。

nnHu 等 (2011) 進一步研究發現 GO 的細胞毒性表現出明顯的濃度依賴性，卻不存在時間依賴性。通過研究 GO 對胎牛血清 FBS 的吸附動力學和比較 GO 在有血清和無血清狀態下的細胞毒性，他們認為 GO 這種非時間依賴性的毒性可能與 GO 和細胞間相互作用有關。當 GO加入含有血清 FBS 的細胞培養基時，GO 表面會吸附培養基中 FBS 形成蛋白包裹體，進而阻礙了 GO 本身與細胞膜的直接作用，從而降低 GO 的細胞毒性；然而，當 GO 加入無血清的細胞培養基時，GO 與細胞可直接相互作用，引發細胞膜損傷，導致細胞死亡。GO 的這種吸附能力主要與其具有大的比表面積和豐富官能團有關。上述研究說明，石墨烯的氧化程度與尺寸大小直接影響其細胞毒性，而且存在明顯的濃度依賴性。不同氧化程度的石墨烯，GO 比 rGO 具有更好的生物相容性。不同尺寸的石墨烯氧化物，細胞毒性隨著尺寸的減小而顯著降低；GO 的尺寸大於 100 nm 時，只有低於一定濃度才表現出良好的生物相容性。這一個結論在其他研究中也得到了很好的證實。

nn目前，石墨烯和細胞相互作用的途徑和機制尚不清楚。關於攝取機制方面，小片層石墨烯氧化物 (500 nm 以下) 主要通過絲狀偽足包裹或網格蛋白介導的內吞作用進去細胞，而大片層石墨烯氧化物 (1~2 μm) 則主要通過吞噬作用進入細胞。毒性機制方面，大多數研究者認為 GO 的細胞毒性主要由氧化應激介導。但也有少數研究認為石墨烯氧化物對細胞的毒性，可能是材料與細胞膜之間相互作用引起的。石墨烯的細胞毒性機制還有待於進一步的研究。

nn石墨烯及其衍生物的動物毒性是石墨烯生物安全性評估的另一重要指標。Zhang 等 (2011) 用放射性同位素錸 (188R) 示蹤 GO，通過尾靜脈將 188R-GO (1 mg╱kg) 注入小鼠體內，發現GO 主要沉積在小鼠肺部，但網狀內皮系統對 GO 的攝取量較少；當 188R-GO 濃度提高到 10 mg╱kg 時，小鼠肺部會出現明顯的病理性改變，提示高劑量的 GO 存在肺毒性。Li 等 (2013) 進一步研究了納米尺寸石墨烯氧化物 (nano-GO, NGO) 對小鼠的毒性作用。研究發現 NGO 處理後的小鼠表現出明顯的急性肺損傷和慢性纖維肺；但該損傷在地塞米松的治療下可以得到緩解，提示 GO 引起的肺毒性可能與氧化應激有關。

nn石墨烯氧化物誘發動物出現的肺損傷是 GO 動物毒性的主要癥狀，但修飾後的GO 可以極大地降低該損傷。Duch 等 (2011) 在研究 GO 肺毒性的同時將 GO 分散於聚丙乙醇和環氧乙烷加聚物n(普朗尼克)，發現 GO 誘發的肺毒性被明顯減弱。Sahu 等 (2012) 將 GO 用普朗尼克製成水凝膠，皮下注射於小鼠，病理蘇木精-伊紅染色法 (HE) 結果顯示，該材料處理n3 周后，注射部位僅顯示出輕度炎性反應，8 周后炎性反應消失；注射期間其他部位並未發現明顯的炎性、組織壞死等病變。

nn石墨烯的生物安全性研究已經積累了一定的研究基礎，但是由於石墨烯製備方法的多樣性和生物系統的複雜性，石墨烯的生物安全性問題仍不能簡單歸納得出結論，需要綜合多方面的因素進行深入研究。但我們堅信只要防範得宜，避免吸入納米級造成的肺損傷，就可以好好的應用這個特別的好東西。