多順反子表達元件——一次滿足你N個願望

02-01

寫在正文之前

前一段時間有讀者留言說，希望多寫一點有關分子克隆的文章。但考慮了一下，覺得常規的克隆比如獲得開放讀碼框（ORF）並表達這種實在過於簡單，現有的教程也不少，似乎沒有再寫一篇的必要了。但不回應一下讀者的需求又似乎不好，想來想去，還是寫一篇與克隆相關但目前還沒有爛大街的文章。這一篇文章集中討論多順反子，後面可能會考慮寫有關Gibsonnassembly的教程。正如以往一般，想了解什麼，就在討論區留言。能力範圍內，本司機都會寫文。

一、引言

利用質粒載體表達外源基因已經不是什麼高深的學問了，但如果我們想同時表達多個基因呢？可能有人會說，那就把多個質粒混合起來轉染。只是這樣的策略，隨著混合質粒的種類增多，隨機性就越大，並不能保證每個細胞都獲得了等量的每種質粒。而如果使用多個啟動子，將各個「啟動子-ORF」拼接起來呢？沒錯，這是個經典的解決方案。但是，這樣的策略可能存在兩個問題：一是啟動子的個頭不小（如常用的CMV啟動子超過500 bp，EF1α啟動子超過1.1nkb），多個啟動子會導致載體顯著增大，可能會給後續的實驗帶來麻煩；二是強啟動子太多，容易給宿主細胞帶來代謝負擔，換用弱啟動子，又覺得表達丰度不夠。而如果我們想實現外源基因的串聯表達——也就是說，前一個基因表達，勢必引起後一個基因表達——那麼多啟動子的策略並不可行。

多順反子元件近乎完美地解決了上述問題。「順反子」（Cistron）可以算是「基因」的舊稱，起源於比較古老的遺傳學實驗，這裡不展開敘述。單順反子，意思就是這段DNA中，含有編碼單一蛋白的基因。而多順反子（Polycistron或Multicistron），顧名思義，就是這段DNA中含有編碼多個蛋白的基因。多順反子常常存在於原核生物中，一個轉錄本，可以翻譯出多個蛋白。而真核生物，則多利用單順反子策略。

在分子克隆中，我們可以利用原核生物的這一特點應用於真核生物之中，即使用多順反子元件載體，將多個ORF串聯起來，同時表達多個基因。其中，IRES元件和2A多肽元件是最常用也是最容易使用的。

二、IRES——Internal Ribosome Entry Site（內部核糖體進入位點）

mRNA的翻譯，依賴於核糖體的結合，並識別起始密碼子，沿著5』→3』端進行。但是，起始密碼子序列（比如AUG）在一個轉錄本中是廣泛存在的，那核糖體又是如何認得最最開始的那個AUG序列呢？其實道理很簡單，在真核生物中，絕大多數轉錄本的翻譯，同時還依賴於5』端的一個特殊結構，簡稱為「帽子」（cap）。只有識別到cap，核糖體才會結合到mRNA，掃描起始密碼子，從而繼續後續的翻譯進程。（具體的生化過程，請自行翻書。）

nn然而，真核生物還有一小部分基因的翻譯，是可以不依賴於cap的。其中研究最為深入的，便是IRES依賴通路。IRES是一個相當古老的基因元件，最早在脊髓灰質炎病毒（Poliovirus）中發現，在部分真核生物的基因（如某些生長因子，甚至某些原癌基因）中也存在。IRES為核糖體在轉錄本的內部提供了一個新的「落腳點」。即使不存在cap，核糖體也能與之結合，並掃描起始密碼子。

如今，IRES成為多個基因串聯表達的實用工具。它最大的優點是，後一個基因的ORF並不需要和前一個基因的ORF同框，因為核糖體會重新掃描後一個基因的起始密碼子，而不依賴於前面的ORF結構。這樣一來，克隆工作就簡單得多了。

但是，IRES也有很明顯的缺陷。一是這個元件的塊頭也不小（500-600nbp），二是後一個基因的表達強度，往往低於前一個基因。

三、2A多肽元件（2A peptide）

和IRES元件一樣，2A多肽元件也最早在病毒中發現（小RNA病毒，Picornavirus），且直到目前為止，僅在病毒中發現。而儘管真核生物基因組中並不存在2A，但2A介導的多順反子表達卻廣泛存在。（註：目前為止，尚未發現原核生物中存在2A介導的多順反子表達途徑。）

2A元件是一類編碼約僅有20個氨基酸多肽的序列（如下圖所示），它能阻止翻譯過程中氨基酸形成共價鍵，並維持翻譯繼續進行。這樣一來，翻譯產物就被「切了一刀」，變成兩段（比較正式的叫法是「順式水解反應」，或者說「自切割」）。2A元件的共有序列是D(V/I)ExNPGP。其中，x是任意氨基酸，而「下刀」切割的位點，就在最後兩個氨基酸G和P之間。

（註：除了上圖明示的序列外，在2A元件的5』端加上編碼GSG三肽的序列，可以顯著提高切割效率）

2A多肽元件用於多基因串聯表達，具有IRES無可比擬的優勢。第一，2A非常短，克隆甚至直接合成非常方便。第二，在理想情況下，2A介導的自切割效率幾乎是100%。這也是目前為止唯一能夠保證串聯基因等量表達的策略。

但是，2A多肽元件也是有缺點的。首先，前一個蛋白的C端會多了一小段外源多肽，後一個蛋白的N端也會多一個脯氨酸（Proline）。雖然在絕大多數情況下，這不會影響蛋白質的功能。但有時候運氣不好起來，什麼事情都有可能發生，做實驗的人都懂。其次，後一個ORF要和前一個ORF同框（貌似這不算是什麼缺點），否則就姨媽（霧——移碼了）。最後，不同的2A多肽，在不同物種甚至細胞種類之間的切割效率是不一樣的（有的能接近100%，有的可能只有50%），在正式實驗之前，最好查查相關文獻。

此外值得注意的是，當要串聯表達3個以上蛋白時（即使用2個以上2A多肽元件），請注意使用不同種類的2A來間隔ORF。否則重複出現相同的序列，在臉不好看的情況下，可能會導致一些奇怪的重組現象。

四、多順反子元件的應用

只要充分發揮想像力，串聯表達多個基因可以有多種多樣的應用。

比如說，製作iPS細胞需要同時表達多個轉錄因子，而將這些轉錄因子通過多順反子整合到一兩個質粒上，無疑方便了轉染，以及提高獲得幹細胞克隆的幾率。

又比如，為了在活細胞中監測某些蛋白的表達情況，我們可以為其加上標籤（如熒光蛋白標籤）。但直接用融合標籤的方法，可能會干擾靶蛋白的功能。而使用多順反子元件，將靶蛋白和熒光蛋白隔開，就可以通過檢測熒光強度獲知靶蛋白的表達情況。

而儘管位於IRES後面的ORF表達效率不高，但這一缺陷卻可以被反過來用於強表達細胞克隆的篩選。比如說，構建一個「p53-IRES-puromycin抗性」的載體轉染細胞。當使用puromycin篩選時，細胞只有在載體插入、重組的拷貝數足夠多，p53的表達足夠高時，才能在抗生素的作用下存活下來。