廉價的活細胞熒光實驗緩衝液

生物狗們最黑暗的時刻，莫過於沒有data，以及蹲在暗房裡面拍confocal……

扯蛋完畢，進入正文。

涉及活細胞的熒光實驗，包括流式細胞分選、激光共聚焦成像等，決定實驗成敗最重要的一點是如何保持細胞的活性。理論上，常規的培養基，包括DMEM或者1640什麼的，便是保證細胞活性的最佳方案。然而，常規培養基中含有大量的熒光物質，會嚴重降低信噪比。

這些造成本底熒光的物質包括：

1、 最著名的pH指示劑Phenolnred（酚紅）。其化學結構含有大量共軛雙鍵，具有熒光特性。研究表明，酚紅的激發波長約在440nnm附近。根據熒光激發的原理，考慮斯托克斯位移（Stokes』nshift），酚紅會發出綠色熒光。因此當我們在做綠色熒游標記時（如GFP，FITC等），酚紅的存在便會造成干擾。

2、 維生素類如Riboflavin（核黃素，維生素B2），它同樣含有大量共軛雙鍵，因此也會干擾我們的熒光實驗。

針對這個問題，已經有公司研發出相應的緩衝液來解決這個問題。比如ThermonFisher旗下Gibco公司的FluoroBrite?nDMEM。根據下圖的廠家測試結果，使用該緩衝液可以有效地提高信噪比。然而這貨一點都不便宜。土豪實驗室可以隨意任性，但荷包緊的就……

前面鋪墊了那麼多，終於進入乾貨的部分。首先我們要理解，維持細胞活性的最低需求是什麼。其實很簡單，只有以下三點：

nn1、 滲透壓

2、 pH值

3、 營養物質

nn滲透壓包含了兩個部分，一個是離子滲透壓，另一個是膠體滲透壓。常規的等滲溶液，包括PBS，生理鹽水等，都能維持離子滲透壓。然而膠體滲透壓往往是容易被忽視的環節。其實只要添加少量的血清或者BSA，就能滿足這個條件了。

nnpH值方面，由於生理鹽水不含緩衝對，因此不適合用於長時間的活細胞實驗。那看來，PBS就沒問題了？其實不然。要讓PBS中緩衝能力其實相當有限，緩衝對的組成比較簡單。這裡，我更加推薦HBSS，除了含有磷酸氫-磷酸二氫緩衝對之外，還有碳酸氫鹽成分。根據個人經驗，添加HEPES這種非營養性的pH緩衝劑，能夠在更長的時間內維持pH穩定。

nn此外，HBSS還含有PBS所不具備的優勢，那就是含有葡萄糖。細胞離開培養基後，如果沒有添加合適的營養物質，那麼很快就會掛掉。本司機曾經研究過細胞在短時間內最低限度的營養需求，其中最重要的是葡萄糖，其次是谷氨醯胺。這兩者恰好也是常規培養基中濃度最高的兩種營養物質。

那麼說了半天，倒是給個配方啊！好吧，見下表：

• 1X HBSS：分為有鈣鎂版和無鈣鎂版，如果做貼壁細胞的成像，那麼要含有鈣鎂，如果細胞是需要製成懸浮狀單細胞的，用無鈣鎂版。（細胞黏附依賴於這些離子）
• 1X GlutaMAX：這裡不用L-Glutamine的原因是，GlutaMAX以液體狀保存，容易使用，且穩定性比L-Glutamine不知道高到哪裡去。
• HEPES：終濃度10-25 mM，這個區間內任意。我習慣用15 mM。
• FBS：終濃度0.5%-2%。我通常是拿平時分裝剩下的一點點血清來用。如果想更省錢，可以用細胞培養級的BSA（終濃度1%）
• 其他可加可不加的東西：青-鏈黴素雙抗（這個可以用來做活細胞分選的buffer，防止污染），EDTA（終濃度10 uM，可以進一步保證細胞懸液呈單細胞狀態。注意，部分細胞對EDTA敏感，如果在跑流式時，發現加了EDTA後FSC降低，那麼就是對細胞活性有影響了。）

使用這個配方，細胞在裡面待幾個小時都沒有問題。

一年前曾經拿這個buffer和普通的PBS進行比較，在製備單細胞懸液後進行96孔板的單細胞分選。其中，細胞置於緩衝液的時間約為1小時。最終，經過兩周培養之後，PBS重懸組只有不到5%的孔能夠發現克隆，而使用上述配方的樣品，成克隆率超過50%。

*****

封面圖下載地址：

http://wallpapercraze.com/images/wallpapers/fluorescence_make_up_w1.jpeg

其實我也就是Google搜fluorescence出來的……